【ScienCell】人角膜成纤维细胞(HK）产品使用攻略
人角膜成纤维细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人角膜成纤维细胞
(HK）
角膜成纤维细胞，或称为角膜角质细胞，是高度专业化的细胞，在角膜基质中夹在正交排列的胶原纤维层之间。角膜角质细胞产生基质胶原和蛋白聚糖，在维持角膜的结构和透明度方面起着关键作用，同时在角膜伤口愈合和组织修复中发挥重要作用，并在创伤中因受到生长因子和细胞因子的影响而发生表型转变。在正常情况下，成年角膜中的角质细胞是相对静止的细胞。然而，在角膜受伤或创伤的情况下，角质细胞会分化为活跃的合成细胞，并迅速替换受损的基质。培养的人角质细胞在细胞表面表达功能性的IL-4受体和IL-17受体，这表明这些细胞可响应IL-4和IL-17介导角膜过敏反应。IL-1处理后观察到角质细胞基因表达的变化，这为了解HK的基因表达提供了重要见解，并提示了控制角膜炎症的新的治疗靶点。HK具有成纤维细胞的形态特征，并且可通过纤连蛋白（fibronectin）特异性抗体免疫荧光染色来进行鉴定。
培养方式
培养瓶：PLL（多聚-L-赖氨酸）包被的培养瓶。
培养基：HK用提供的FM完全培养基（包含基础培养基、2% FBS、1%FGS和1% P/S）培养。
操作步骤：
1) 包被PLL（2 μg/cm2）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL PLL原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。
2) 无菌水清洗包被PLL T-75 2次，加入20 mL FM完全培养基（基础培养基、FBS、FGS和P/S按比例混合配制），将解冻后的HK加入至包被的T-75中，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，细胞在PLL包被培养瓶中有助于促进细胞附着。）
换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。
传代：当细胞密度达到90%-95%时进行传代。
1) 将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。
2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除，加入5 mL DPBS和5 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱，一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入2 mL FBS（#0500）终止消化，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm2的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶中。
生长条件：在CO2浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。
表1 HK培养材料
参考文献
[1] Fini ME. (1999) “Keratocyte and fibroblast phenotypes in the repairing cornea.” Prog Retin Eye Res. 18: 529-51.
[2] Fukuda K, Fujitsu Y, Kumagai N, Nishida T. (2002) “Characterization of the interleukin-4 receptor complex in human corneal fibroblasts.” Invest Ophthalmol Vis Sci. 43: 183-8.
[3] Maertzdorf J, Osterhaus AD, Verjans GM. (2002) “IL-17 expression in human herpetic stromal keratitis: modulatory effects on chemokine production by corneal fibroblasts.” J Immunol. 169: 5897-903.
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