【Cellntec】 一般细胞培养方式（含细胞复苏、培养、传代、冻存）
细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
细胞复苏
1.将所需量的培养基加入到所需的培养容器中，并在细胞培养箱中平衡至少30 min，以预热培养基并调整到生理pH值。
2.在37°C的水浴中轻轻旋转冻存管，直到刚刚融化。从液氮或-80°C取出的冻存管必须迅速解冻，同时确保解冻的细胞温度不超过4°C（在仍有一些冰晶的情况下从水浴中取出冻存管）。
3.使用移液管将冻存管中的细胞重悬，并将整个内容物（1 mL）转移到已准备平衡好的的细胞培养容器中。冻存培养基中的DMSO含量为10%，在培养基中播种后，必须将其稀释至少于1%（10倍稀释）。
4.每个培养容器播种的体积根据推荐每平方厘米的接种密度进行计算。重要提示：培养基需要在细胞播种后6~24 h更换，以去除冻存培养基中的残留DMSO。
细胞培养
1.在常规培养过程中，培养基应每2~3天更换一次。吸除旧的培养基，并用相同体积的新培养基替换。
2.对于常规细胞培养，建议不使用抗生素/抗真菌药物。然而，在细胞分离过程中，建议在第2代传代前使用抗生素/抗真菌药物。
细胞传代
1. 当细胞密度达到70~90%时，进行传代。不要让细胞达到100%的密度，因为这会触发分化，并导致后续传代的细胞生长不良。
2. 吸去培养容器中培养基。
3. 添加100 μL/cm2的PBS（不含钙和镁）洗涤细胞，轻轻旋转培养容器以冲洗细胞，随后吸去PBS。
4. 向细胞中加入50 μL/cm2的解离酶。推荐使用Accutase（将其加热至室温）。37°C孵育，直到细胞变圆并开始脱落。在显微镜下检查细胞的脱落情况。轻拍培养容器，以移除任何残留的附着细胞。
5. 使用Accutase时，向脱落的细胞中加入2.5倍体积的培养基以终止酶的作用。使用Trypsin / EDTA时，加入相同体积的胰蛋白酶抑制剂。
6. 用悬浮液冲洗培养容器底部2至3次，以去除所有细胞并将其分离成单个细胞悬浮液，随后转移到离心管中在离心管中静置3分钟，使细胞完全沉淀。
7. 在室温下200 g离心5分钟。吸去上清液，加入 1至2 mL的培养基以重悬细胞，计算活细胞数。
8. 刚分离细胞的推荐接种密度为12,000 cells/cm2。传代后推荐的接种密度：1,000 cells/cm2。
细胞冻存
在冷冻过程开始之前，将所需数量的冻存瓶进行标记并预冷至4°C。
1. 只有生长良好的细胞才应该被冷冻。
2. 使用上述的传代方案将细胞分离。室温200 g离心5分钟。加入1 mL的培养基重悬细胞沉淀。
3. 将细胞放在冰上，然后取样进行细胞计数。
4. 使用冷（4°C）的培养基调整细胞浓度为所需最终浓度的两倍（例如，如果所需细胞浓度为1×106 cells/mL，则将细胞浓度调整为2×106 cells/mL）。
5. 滴加相同体积的冷（4°C）2×的冻存培养基，同时轻轻旋转试管。一旦添加了所有的冻存培养基，静置5分钟，使细胞的细胞质渗透平衡。缓慢添加和平衡静置5分钟很重要，以达到正确的渗透平衡而不引起冲击。
6. 将1 mL的细胞悬浮液转移到每个标记和预冷的冻存管中。将冻存管装入程序降温盒后转移到-80°C。
7.允许冻存管过夜冷冻，然后将其转移到液氮中进行长期储存。
其他细胞品类
别划走，精彩继续
长按识别
添加一对一专属技术支持
扫码进群
咨询详细产品信息
点在看，传递你的品味
