【ScienCell】人无色睫状上皮细胞(HNPCEpiC）产品使用攻略
人无色睫状上皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人无色睫状上皮细胞
(HNPCEpiC）
纤毛上皮位于后室纤毛突起的叶状突起上，覆盖基质和血管的核心，由两层柱状细胞组成。纤毛上皮在结构上和功能上明显不同，上皮的外层有色素，但位于房水旁边的内层则没有。在哺乳动物眼中，非色素化的睫状上皮细胞( NPCEpiC )在很大程度上负责房水流入。NPCEpiC通过溶质转运产生渗透梯度，从而导致水从基质进入后房。研究表明NPCEpiC参与光转导所需大分子的合成和纤毛体内罕见腺瘤的发生。HNPCEpiC可通过cytokeratin-18和cytokeratin-19特异性抗体免疫荧光染色鉴定。
培养方式
培养瓶：PLL（多聚-L-赖氨酸）包被的培养瓶。
培养基：HNPCEpiC在提供的EpiCM完全培养基（包含基础培养基、2% FBS、1% EpiCGS和1% P/S）中培养。
操作步骤：
1) 包被PLL（2 μg/cm2）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL PLL原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。
2) 无菌水清洗包被PLL的T-75 2次，加入20 mL EpiCM完全培养基（基础培养基、FBS、EpiCGS和P/S按比例混合配制），将解冻后的HNPCEpiC加入至包被的T-75中，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，将细胞放置在PLL涂层的培养瓶中有助于促进细胞附着。）
换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。
传代：当细胞密度达到90%时进行传代。
1) 将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。
2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入10 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱，一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入5 mL FBS（#0500）终止消化，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm2的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶中。
生长条件：在CO2浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。
表1 HNPCEpiC培养材料
参考文献
[1] Kiel JW, Hollingsworth M, Rao R, Chen M, Reitsamer HA. (2012) “Ciliary Blood Flow and Aqueous Humor Production.” Prog Retin Eye Res. 30: 1-17.
[2] Bertazolli-Filho R, Ghosh S, Huang W, Wollmann G, Coca-Prados M. (2001) “Molecular evidence that human ocular ciliary epithelium expresses components involved in phototransduction.” Biochem Biophys Res Commun. 284:317-25.
[3] Chen ZQ, Fang XY. (2007) “Adenoma of nonpigmented epithelium in ciliary body: literature review and case report.” J Zhejiang Univ Sci B. 8: 612-5.
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