【ScienCell】人无色睫状上皮细胞(HNPCEpiC)产品使用攻略

【ScienCell】人无色睫状上皮细胞(HNPCEpiC)产品使用攻略

小白求助 前辈指路


人无色睫状上皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办?新手小白迫切求助,希望各位前辈在文章下方留言,分享自己的经验,为小白们答疑解惑!


人无色睫状上皮细胞

(HNPCEpiC)

纤毛上皮位于后室纤毛突起的叶状突起上,覆盖基质和血管的核心,由两层柱状细胞组成。纤毛上皮在结构上和功能上明显不同,上皮的外层有色素,但位于房水旁边的内层则没有。在哺乳动物眼中,非色素化的睫状上皮细胞( NPCEpiC )在很大程度上负责房水流入。NPCEpiC通过溶质转运产生渗透梯度,从而导致水从基质进入后房。研究表明NPCEpiC参与光转导所需大分子的合成和纤毛体内罕见腺瘤的发生。HNPCEpiC可通过cytokeratin-18和cytokeratin-19特异性抗体免疫荧光染色鉴定。


 培养方式


培养瓶:PLL(多聚-L-赖氨酸)包被的培养瓶。

培养基:HNPCEpiC在提供的EpiCM完全培养基(包含基础培养基、2% FBS、1% EpiCGS和1% P/S)中培养。

操作步骤:

1) 包被PLL(2 μg/cm2)培养瓶(T-75培养瓶)的准备:将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中,加入15 μL PLL原液,轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜(或至少1小时)。

2) 无菌水清洗包被PLL的T-75 2次,加入20 mL EpiCM完全培养基(基础培养基、FBS、EpiCGS和P/S按比例混合配制),将解冻后的HNPCEpiC加入至包被的T-75中,十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀,将培养瓶放入细胞培养箱中。(注:不建议在解冻后稀释和离心细胞,因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜(DMSO)的影响更大。同时,将细胞放置在PLL涂层的培养瓶中有助于促进细胞附着。)

换液:为了获得最佳结果,在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基,以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞,之后每隔三天更换一次培养基,直到培养达到约70%的密度,一旦培养达到约70%的密度,每隔一天更换一次培养基,直到培养达到约90%的密度。

传代:当细胞密度达到90%时进行传代。

1) 将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡(不建议37℃加热)。

2) 弃除旧培养基,并用DPBS清洗细胞后吸除加入10 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱,一段时间后镜下观察,待细胞完全变圆、脱落,轻轻拍打底部和侧面,加入5 mL FBS(#0500)终止消化,将细胞悬液转移至50 mL离心管中,1000 rpm离心5 min,用新培养基重悬细胞沉淀后计数,根据5000 cells/cm2的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶中。

生长条件:在CO2浓度为5%,温度为37℃,相对湿度(RH)为95%的细胞培养箱中培养。

表1 HNPCEpiC培养材料

参考文献

[1] Kiel JW, Hollingsworth M, Rao R, Chen M, Reitsamer HA. (2012) “Ciliary Blood Flow and Aqueous Humor Production.” Prog Retin Eye Res. 30: 1-17.

[2] Bertazolli-Filho R, Ghosh S, Huang W, Wollmann G, Coca-Prados M. (2001) “Molecular evidence that human ocular ciliary epithelium expresses components involved in phototransduction.” Biochem Biophys Res Commun. 284:317-25.

[3] Chen ZQ, Fang XY. (2007) “Adenoma of nonpigmented epithelium in ciliary body: literature review and case report.” J Zhejiang Univ Sci B. 8: 612-5.

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