【ScienCell】人角膜上皮细胞(HCEpiC）产品使用攻略

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小白求助前辈指路

人角膜上皮细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

人角膜上皮细胞

(HCEpiC）

角膜是一种独特的组织，因其透明性和无血管性而与众不同。角膜由三个明显的细胞层组成：外层上皮、中央基质和内层内皮。角膜上皮通过感知病原体的存在并提供信号来激活角膜防御系统，在先天免疫反应中发挥作用。角膜上皮细胞表达高水平的醛脱氢酶，以保护其免受紫外线和4-羟基壬醛引起的细胞损伤，同时角膜上皮的更新由一系列细胞因子调节，包括表皮生长因子，这些因子在上皮的深层激活其对应的受体。培养的角膜上皮细胞可作为研究毒理学的有效工具。HCEpiC在无血清培养条件下具有鹅卵石状形态，可通过细胞角蛋白-18（cytokeratin-18）和细胞角蛋白-19（cytokeratin-19）特异抗体的免疫荧光染色进行鉴定。

培养方式

培养瓶：PLL（多聚-L-赖氨酸）包被的培养瓶。

培养基：HCEpiC用提供的CEpiCM完全培养基（包含完全培养基、1% CEpiCGS和1% P/S）中培养。

操作步骤：

1) 包被PLL（2 μg/cm²）培养瓶（T-75培养瓶）的准备：将10 mL无菌水加入到T-75培养瓶中，加入15 μL PLL原液，轻轻吹匀后将培养瓶放置在37°C的孵育箱中过夜（或至少1小时）。

2) 无菌水清洗包被PLL的T-75 2次，加入20 mL CEpiCM完全培养基（基础培养基、CEpiCGS和P/S按比例混合配制），将解冻后的HCEpiC加入至包被的T-75，十字交叉法轻柔摇晃培养瓶使细胞分布均匀，将培养瓶放入细胞培养箱中。（注：不建议在解冻后稀释和离心细胞，因为这些操作对细胞的伤害比培养中残留的二甲基亚砜（DMSO）的影响更大。同时，细胞在PLL包被培养瓶中有助于促进细胞附着。）

换液：为了获得最佳结果，在培养开始后至少16小时内不要干扰培养。第二天更换培养基，以去除残留的二甲基亚砜和未附着的细胞，之后每隔三天更换一次培养基，直到培养达到约70%的密度，一旦培养达到约70%的密度，每隔一天更换一次培养基，直到培养达到约90%的密度。

传代：当细胞密度达到90%时进行传代。

1) 将T/E、DPBS、培养基提前置于室温平衡（不建议37℃加热）。

2) 弃除旧培养基，并用DPBS清洗细胞后吸除加入10 mL 0.05% T/E solution 轻柔晃动培养瓶后放入37℃培养箱（注：原代细胞传代时请勿使用未稀释的胰蛋白酶），一段时间后镜下观察，待细胞完全变圆、脱落，轻轻拍打底部和侧面，加入5 mL FBS（#0500）终止消化，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，1000 rpm离心5 min，用新培养基重悬细胞沉淀后计数，根据5000 cells/cm²的密度传代至预先用PLL包被的培养瓶中。

生长条件：在CO₂浓度为5%，温度为37℃，相对湿度（RH）为95%的细胞培养箱中培养。

表1 HCEpiC培养材料

参考文献

[1] Zhang J, Wu XY, Yu FS. (2005) “Inflammatory response of corneal epithelial cells to pseudomonas aeruginosa infection.” Curr Eye Res. 30: 527-34.

[2] Pappa A, Brown D, Koutalos Y, Degregori J, White C, Vasiliou V. (2005) “Human aldehyde dehydrogenase 3A1 inhibits proliferation and promotes survival of human corneal epithelial cells.” J Biol Chem. 280: 27998-8006.

[3] Lu L, Reinach PS, Kao WW. (2001) “Corneal epithelial wound healing.” Exp Biol Med (Maywood). 226: 653-64.

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