【ATCC】脂肪来源的间充质干细胞和前体脂肪细胞的分化
脂肪来源的间充质干细胞培养不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
人脂肪来源的间充质干细胞
（HMSC）
间充质干细胞（MSC）是一类成体干细胞，具有发展成脂肪、软骨、骨骼、肌腱和肌肉的成熟细胞的潜力。由于MSC在再生医学中有潜力用于替代受损组织而引起关注。在转化生长因子存在下，无血清培养的MSC将分化为软骨细胞。相反，在含有抗坏血酸和地塞米松的血清培养基中，MSC将分化为成骨细胞。MSC具有自我更新和分化成各种间充质组织的能力。凭借其自我更新的能力，MSC有潜力移植到受伤部位或种植在生物仿生支架上，以生成适当的组织构建物。
HMSC分离自人的脂肪组织，其CD73和CD90特异性抗体免疫荧光染色呈阳性，分化后的成熟脂肪细胞可进行油红O染色，分化后的骨细胞可进行茜素红染色。
开始脂肪细胞分化之前脂肪来源的间充质干细胞（Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells，ATCC PCS-500-011）不要传代超过4次。
分化前的培养
1) 当细胞密度达到70-80%时，将它们传代到组织培养板中，密度为18,000 cells/cm²。根据使用的组织培养板的表面积，调整细胞数量和培养基的体积。例如：对于一个表面积为9.5 cm²/孔的6孔组织培养板，向每个含有2毫升间充质干细胞基础培养基（ATCC PCS-500-030）和间充质干细胞生长试剂盒-低血清（ATCC PCS-500-040）成分的孔中添加总共171,000个活细胞。
2) 在孵育之前，轻轻摇晃培养板，使细胞均匀分布。
3) 在开始脂肪细胞分化之前，将细置于37°C、5% CO₂细胞培养箱中孵育48小时。
分化培养基的配制
脂肪细胞分化过程需要两种独立的培养基制备：一种用于起始，一种用于维持。这些培养基可以提前按如下方式提前制备：
1) 将分化试剂盒的所有三个组分解冻，并在水浴中加热至37°C。注意：在加热过程中，需要摇晃AD补充物和ADM补充物，以帮助溶解可能在冷冻过程中沉淀出来的组分。
2) 用70%乙醇喷洒在三个试剂盒组分的外部表面，进行消毒。
3) 分化前96小时使用的脂肪细胞分化启动培养基的配制：①分别使用无菌移液管，将15 mL脂肪细胞基础培养基和1 mL AD补充物转移到一个无菌的50mL离心管中。
4) 脂肪细胞分化维持培养基的配制：①向剩余的85 mL脂肪细胞基础培养基中加入5毫升ADM补充物。
5) 紧密盖好每个培养基容器，并轻轻摇晃使其均匀混合。不要剧烈摇晃以避免起泡。标记和注明日期。
6）配好的每个分化培养基应在2°C至8°C的避光条件下储存（不要冷冻），可稳定储存三周。
脂肪分化的过程
初始阶段：
1)孵育了预先准备的脂肪来源的间充质干细胞（如上所述）后，小心地将旧培养基从孔中吸出，并向每个孔中加入2 mL室温平衡的D-PBS（ATCC 30-2200）清洗一次，然后小心地将PBS从孔中吸出。
2)向每个孔中加入2 mL预热（37°C）的脂肪细胞分化启动培养基，并将细胞放入37°C、5% CO2培养箱中孵育48小时，以开始脂肪细胞分化过程。注意：建议在每次加培养基前将所需体积的培养基转移到无菌管中进行预热，而不是反复预热整个储存培养基。
3)小心地从每个孔中取出一半体积的培养基（1 mL），然后向每个孔中另外加入2 mL预热（37°C）的脂肪细胞分化启动培养基来培养细胞。重要提示：在吸液过程中不要倾斜培养板。在此和后续步骤中，确保细胞单层不暴露在空气中，以确保发育中的脂质囊泡不会破裂。
维持阶段：
1)每隔3-4天，根据以上换液方式对细胞进行换液，直到脂肪细胞达到完全成熟为止。（完全成熟将在启动阶段开始后的15天达到，或从细胞最初培养开始算起的17天达到。）
2)根据实验设计，细胞可以在脂肪细胞分化的任何阶段使用。为了确认脂质积情况累，可以固定细胞并用Oil Red O染色。
表 1 脂肪分化培养材料
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