【Serumwerk】隐孢子虫卵囊（Cryptosporidium oocysts）纯化

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Serumwerk Bernburg AG 18003 Nycodenz®

小白求助前辈指路

隐孢子虫卵囊纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

隐孢子虫卵囊（Cryptosporidium oocysts）纯化

背景

细小隐孢子虫和隐孢子虫卵囊从粪便中纯化，通常从牛或猪的来源，通常在简单的两层NycodenzⓇ梯度，尽管部分分离1型和2型卵囊线性梯度相同的溶质使用。NycodenzⓇ溶液由磷酸盐缓冲盐或水组成；两种溶剂之间的密度会有微小的差异，否则溶剂不太可能对分离产生任何显著影响。

样品制备

Widmer等首先通过纱布过滤或低速离心去除粪便中的粗碎片。然后将悬液与2卷的饱和氯化钠混合，1000 g离心15 min。用3 vol水稀释上清后，粗卵囊4000 g颗粒15 min，然后在小体积水中再悬浮。

Akiyoshi等将粪便以4000 g离心10-15 min浓缩。颗粒用0.5% Tween 80重悬，通过纱布过滤去除碎片。用等体积的乙醚涡旋后，悬浮液在4000 g下重离心，并吸出所有的乙醚和水溶液层。粗卵囊最终再次被重悬在少量的水中。

梯度净化

Widmer等人使用15%和30% (w/v) NycodenzⓇ的双层梯度在100,000 g下离心1 h;此方法在文献3-6中也有报道。Akiyoshi等人和Chappell等人使用10%和25%的层和更温和的4000克离心条件30分钟。Zuckerman等人使用同样的梯度但更高的g力- 20000克。要制作100毫升25%或30% (w/v) NycodenzⓇ的原液，放置大约。50 ml水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，存于150 ml烧杯中，置于加热的磁力搅拌器中，设置约为100 ml。50℃并以少量添加25 g或30 g NycodenzⓇ直至溶解。使溶液冷却到室温，然后用所选溶剂配制多达100 ml。必要时进行过滤消毒。用水(或PBS)稀释原液，制成10%或15% (w/v)的溶液，然后将2.5 ml的NycodenzⓇ溶液分层放入用于摆动桶转子的管中，然后根据需要取样和离心。卵囊在两个NycodenzⓇ溶液之间的界面处呈带状。

分离1型和2型卵囊使用线性15-30%或15-25% (w/v) NycodenzⓇ连续梯度和50000 g离心1 h。2型卵囊从梯度的上半部分回收，虽然1型卵囊主要在梯度的下半部分，但这里也有大量的2型卵囊。

Nycodenz® 产品信息

理化特性

●分子量：821 g/mol

●密度：2.1 g/ml

●溶于水浓度：80% (w/v)，溶于水密度：1.426 g/ml

稳定性和储存

●固体形式的Nycodenz®在室温和避光条件下可稳定保存2年。

产品特点

●非离子型，对细胞无毒，代谢惰性

●可用于细胞、亚细胞细胞器和膜、大分子和病毒的分离

●形成真正的溶剂。因此，分离后很容易从细胞中除去培养基

●能抵抗细菌降解

●溶液可以进行高压灭菌

使用方法

1. 通过离心在原位形成的(自形成渐变)。

2. 将所需浓度的溶液分层放入适当的离心管和允许的解决方案扩散。使用Nycodenz®等渗溶液梯度可以在45分钟内简单地准备好。

3. 冷冻和解冻。

4. 梯度混合器。

应用

Nycodenz®可用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白的分离。此外，在等渗或轻度高渗条件下，大多数类型的亚细胞器都可以在Nycodenz®的梯度上成功分离。Nycodenz®渗透压低，无毒，是分离完整活细胞的理想介质。Nycodenz®的低粘度及其非离子特性已经证明了Nycodenz®在病毒和细菌的分离和纯化方面是有用的。

可分离：

哺乳动物和非哺乳动物的细胞

亚细胞的细胞器

非哺乳动物来源的细胞器

亚细胞的膜

蛋白质和蛋白质复合物

核糖核蛋白

病毒

Nycodenz®可以通过透析、超滤或凝胶过滤从样品中去除。细胞、亚细胞细胞器和其他颗粒物质可以通过离心从Nycodenz®中分离出来，而不会有被Nycodenz®污染的风险。

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