【Serumwerk】大鼠肺泡II型肺细胞、淋巴系细胞和髓系细胞的分离
大鼠肺泡II型肺细胞、淋巴系细胞和髓系细胞的分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
大鼠肺泡II型肺细胞、淋巴系细胞和髓系细胞的分离
（Rat alveolar type II pneumocytes, lymphoid cells, and myeloid cells）
细胞悬液制备
1．大鼠被麻醉，并注射肝素作为抗凝血剂。
2．气管切开术后，血管灌注缓冲盐水，如140 mM氯化钠，5 mM氯化钾，2.5 mM磷酸氢二钠，10 mM HEPES，2.0 mM氯化钙，1,3 mM硫酸镁，pH 7.4，以去除血细胞。有时还会补充葡萄糖、制霉菌素和抗菌抗真菌药物。
3．为了去除巨噬细胞，分别用140 mM氯化钠、5 mM氯化钾、2.5 mM磷酸氢二钠、10 mM HEPES、6 mM葡萄糖、0.2 mM EGTA、pH 7.4灌洗几次，然后用步骤2缓冲液灌洗。有时灌洗过程使用第2步缓冲液（减去二价阳离子），然后是第2步缓冲液。
4．用弹性蛋白酶或原酶灌洗细胞部分分解
5．去除气管后，肺组织在含有DNaseI（步骤2缓冲液）和胎牛血清的溶液中切碎，然后在胰蛋白酶烧瓶中37℃孵育5 min。
所需溶液制备
1．NycodenzⓇ粉末
2．NycodenzⓇ溶剂：3 mM氯化钾，0.3 mM EDTA，5 mM HEPES-NaOH，pH 7.5（溶液1）
3．工作溶液稀释剂：0.75%（w/v）氯化钠、3 mM氯化钾、0.3 mM EDTA、5 mM HEPES-NaOH、pH 7.5（溶液2）
试验方案
1．在溶液1中制备27.6% (w/v) NycodenzⓇ原液。将50ml溶液1置于150ml烧杯中，磁搅拌器设置为50℃并添加少量NycodenzⓇ直至溶解。让溶液冷却到室温，然后用溶液1配制最多100毫升。必要时进行过滤消毒。
2．用溶液2稀释NycodenzⓇ原溶液以产生用于连续梯度的4.6% (w/v) NycodenzⓇ溶液或用于不连续梯度的20.7%、13.8%和4.6% NycodenzⓇ的三种溶液。
3．用2层和4层纱布依次过滤肺组织(置于约25 ml缓冲液中)，然后用100、37和15 ρm的尼龙网过滤。
4．用细胞悬浮缓冲液稀释至50 ml，130 g离心10分钟。
5．将细胞颗粒悬浮于含2%胎牛血清的DMEM中。
6．使用双腔梯度标记器或Gradient Master™分别使用4 ml 27.6%和4.6% NycodenzⓇ溶液产生1.03-1.15 g/ml的连续NycodenzⓇ梯度。
7．或者通过从注射器和金属套管进行分层，从27.6%、20.7%、13.8%和4.6%的NycodenzⓇ溶液各2 ml产生不连续梯度，并允许通过扩散形成连续梯度。
8．将细胞悬浮液(约1 × 107个细胞/ml)置于梯度上方使其覆盖3 ml。
9．在15℃下以1500 g离心20 min。
10．收集细胞条带(大约在1.056 g/ml)在样品/梯度界面下方。
Nycodenz® 产品信息
理化特性
●分子量：821 g/mol
●密度：2.1 g/ml
●溶于水浓度：80% (w/v)，溶于水密度：1.426 g/ml
稳定性和储存
●固体形式的Nycodenz®在室温和避光条件下可稳定保存2年。
产品特点
●非离子型，对细胞无毒，代谢惰性
●可用于细胞、亚细胞细胞器和膜、大分子和病毒的分离
●形成真正的溶剂。因此，分离后很容易从细胞中除去培养基
●能抵抗细菌降解
●溶液可以进行高压灭菌
使用方法
1. 通过离心在原位形成的(自形成渐变)。
2. 将所需浓度的溶液分层放入适当的离心管和允许的解决方案扩散。使用Nycodenz®等渗溶液梯度可以在45分钟内简单地准备好。
3. 冷冻和解冻。
4. 梯度混合器。
应用
Nycodenz®可用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白的分离。此外，在等渗或轻度高渗条件下，大多数类型的亚细胞器都可以在Nycodenz®的梯度上成功分离。Nycodenz®渗透压低，无毒，是分离完整活细胞的理想介质。Nycodenz®的低粘度及其非离子特性已经证明了Nycodenz®在病毒和细菌的分离和纯化方面是有用的。
可分离：
哺乳动物和非哺乳动物的细胞
亚细胞的细胞器
非哺乳动物来源的细胞器
亚细胞的膜
蛋白质和蛋白质复合物
核糖核蛋白
病毒
Nycodenz®可以通过透析、超滤或凝胶过滤从样品中去除。细胞、亚细胞细胞器和其他颗粒物质可以通过离心从Nycodenz®中分离出来，而不会有被Nycodenz®污染的风险。
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