【Serumwerk】大鼠肝脏的内吞作用：溶酶体和晚期核内体（Lysosomes and late endosomes）分析

（Lysosomes and late endosomes）

溶液制备

A.均质培养基:0.25 M蔗糖，1 mM MgCl₂，10 mM TES-NaOH, pH 7.4

B. Nycodenz®缓冲液:10 mM EDTA, 100 mM TESNaOH, pH 7.4

C.梯度稀释剂:0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM TES-NaOH, pH 7.4

根据需要将蛋白酶抑制剂添加到溶液A-C中。

试验方法

1．准备Nycodenz®原液（45%，w/v）：在150毫升烧杯中，在约50毫升烧杯中加入约50毫升水，缓慢加入45克Nycodenz®。当所有Nycodenz®已溶解时，使溶液冷却至室温;加入10毫升B溶液，加水至100毫升。此可经过滤灭菌并于4℃下储存。

2．配制20% (w/v) Nycodenz®:将步骤1中制备的45% Nycodenz®溶液2体积与2.5体积溶液C混合。

3．在溶液C中配制20% (w/v)聚蔗糖。

4．将步骤1-3中制备的溶液放在冰上，在4℃下进行以下操作。

5．用合适的配体灌注肝脏后，用溶液A灌注，直至肝叶充分焯白。

6．把肝脏切到烧杯里，然后用剪刀剪碎。

7．大约搅拌碎肝。取10毫升溶液A，待肉糜沉淀后再倒入。

8．将大约一半的肉末放入约20毫升的溶液a中，转移到波特-艾维杰姆匀浆机中，用杵以约20毫升的速度旋转3-5次使其均质。2000转/分钟。

9．对另一半肉末重复上述步骤。

10．将匀浆2000 g离心10分钟，沉淀细胞碎片、细胞核和大部分重线粒体。

11．将12.5 ml 20%聚蔗糖转移到用于VTi50转子的36 ml Optiseal管中，然后使用注射器和金属套管底层，使用12.5 ml 20% Nycodenz®和4 ml 45% Nycodenz®溶液。

12．在上面层2000克上清液，以填充管，由制造商指定。

13．在20000g离心1小时，使用缓慢的加速和减速程序最高和低于2000转(或关闭制动低于2000转)。

14．在分析之前，在一系列等体积分数中获取梯度。

方法注释

1．目前尚不清楚碘克沙醇是否可以在此应用中替代Nycodenz®。当然，碘克沙醇作为60% (w/v)溶液(OptiPrep™)的可用性使梯度溶液制备比使用Nycodenz®的情况更容易。碘克沙醇和Nycodenz®溶液的相同% (w/v)浓度有几乎相同的密度，但溶液Nycodenz®是高渗高于1.15 g/ml，相比之下，碘克沙醇可以在所有密度等渗。Nycodenz®溶液的渗透压摩尔浓度是否在实现本应用说明书中所述的分离中起重要作用尚不清楚。只能根据经验进行比较。

2．如果没有垂直转子，可以使用固定角度或摆动斗转子，但这些转子的沉降路径长度较长，将需要更长的离心时间。

3．虽然原来的方法使用了Ficoll，但可以替代分子量几乎相同的Axis-Shield产品多蔗糖。在配制这些高分子量蔗糖聚合物的溶液时，最好在称重后的粉末中加入小等分的溶剂(2-3 ml)，每次添加后使用玻璃棒混合均匀。

4．Ellis等人制备了一种更浓缩的Ficoll水溶液(每克1 ml)，然后在大量的水中透析2小时，并将其调整到适当的浓度(0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM TES-NaOH, pH 7.4)。在0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM TES-NaOH, pH 7.4中配制25% (w/v)的多聚蔗糖，并在相同的培养基中透析，然后检查和调整体积，使其相对于多聚蔗糖为20%，这可能更容易。

5．也被用于分离溶酶体和内体的一种简化方法，其中省略了20%多蔗糖层。

6．可使用约在连续的1-22%多聚蔗糖梯度(具有45% Nycodenz®垫层)上实施轻且致密的核内体的更详细分析。相同的梯度体积、转子和离心条件。垫层界面处含有溶酶体和致密核内体的材料可在0-35%或0-45% Nycodenz®梯度下重新分析。

7．通过导管穿刺，Maxidens®向上移位，或从半月板抽吸，收集梯度约1ml。

8．45%/20% Nycodenz®界面的溶酶体带，20% poly蔗糖/20% Nycodenz®的非常致密的核内体;所有其他核内体在样品/20%多聚蔗糖界面处出现。

9．该方法已被广泛用于研究固醇和氧化固醇在脂质巨噬细胞(泡沫细胞)中的亚细胞分布;它们氧化LDL的能力以及对环糊精反应的游离和酯化胆固醇的动员。也被用于研究溶酶体膜蛋白在细胞内乳酰神经酰胺运输中的作用。

理化特性

●分子量：821 g/mol

●密度：2.1 g/ml

●溶于水浓度：80% (w/v)，溶于水密度：1.426 g/ml

稳定性和储存

●固体形式的Nycodenz®在室温和避光条件下可稳定保存2年。

●非离子型，对细胞无毒，代谢惰性

●可用于细胞、亚细胞细胞器和膜、大分子和病毒的分离

●形成真正的溶剂。因此，分离后很容易从细胞中除去培养基

●能抵抗细菌降解

●溶液可以进行高压灭菌

1. 通过离心在原位形成的(自形成渐变)。

2. 将所需浓度的溶液分层放入适当的离心管和允许的解决方案扩散。使用Nycodenz®等渗溶液梯度可以在45分钟内简单地准备好。

3. 冷冻和解冻。

4. 梯度混合器。

Nycodenz®可用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白的分离。此外，在等渗或轻度高渗条件下，大多数类型的亚细胞器都可以在Nycodenz®的梯度上成功分离。Nycodenz®渗透压低，无毒，是分离完整活细胞的理想介质。Nycodenz®的低粘度及其非离子特性已经证明了Nycodenz®在病毒和细菌的分离和纯化方面是有用的。

可分离：

哺乳动物和非哺乳动物的细胞

亚细胞的细胞器

非哺乳动物来源的细胞器

亚细胞的膜

蛋白质和蛋白质复合物

核糖核蛋白

病毒

Nycodenz®可以通过透析、超滤或凝胶过滤从样品中去除。细胞、亚细胞细胞器和其他颗粒物质可以通过离心从Nycodenz®中分离出来，而不会有被Nycodenz®污染的风险。

相关产品推荐