【Serumwerk】从锥虫（和其他原生动物）和革兰氏阴性菌中分离酸钙切体（Acidocalcisomes）

溶液制备

A. OptiPrep™(60% w/v，碘克沙醇)

B. 裂解缓冲液：0.125 M蔗糖，50 mM KCl, 4 mM MgCl₂，0.5 mM EDTA, 5 mM二硫苏糖醇(DTT)，20 mM Hepes-KOH, pH 7.2

C. OptiPrep™稀释剂：0.125 M蔗糖，0.3 M KCl, 24 mM MgCl₂，3.0 mM EDTA, 30 mM DTT, 120 mM Hepes-KOH, pH 7.2

D. 碘克沙醇(50% w/v)工作溶液：混合5体积OptiPrep™+ 1体积溶液C

试验方法

酸钙质体（Acidocalcisomes）分离

1．通过使用标准程序用碳化硅研磨来裂解洗涤的上鞭毛。

2．将溶解的细胞在溶液B中以144 g离心5 min。

3．滗出上清液，以325 g离心10分钟。

4．滗出并保留上清液。

5．将颗粒重悬于溶液B中并以325 g重复离心10 min。

6．合并两种上清并以10,500 g离心30 min。

7．通过注射器的22号针头重复通过溶液B (4 ml)中重新悬浮颗粒。

8．用溶液B将溶液D稀释，制备含24%、28%、34%、37%和40% (w/v)碘克沙醇的密度梯度溶液。

9．每层4毫升密度梯度溶液和层重悬的10,500 g颗粒在不连续梯度的顶部，以填充管。

10．以50,000 g离心60分钟。

11．酸性钙体在梯度底部形成一个小球。如果主要感兴趣的是分离酸钙体，则抽吸梯度并将颗粒重新悬浮在合适的培养基中。如果目的也是分析其他细胞器，则以15-20等体积分数收集梯度。

酸钙小体和收缩液泡（Acidocalcisomes and contractile vacuoles）分离

1. 依次使用两次36 g 5 min离心和一次144 g 10 min离心来澄清裂解产物。

2. 以100,000 g将最终上清液离心1 h。

3.通过注射器的22号针头重复通过溶液B (2 ml)重悬颗粒。

4. 将悬浮液与等体积的溶液D和0.15 ml的溶液B混合，调整为24% (w/v)碘克沙醇。

5. 用溶液B将溶液D稀释，配制含15%、20%、28%、34%、37%和40% (w/v)碘克沙醇的密度梯度溶液。

6. 在选定转子的管中，每层4 ml密度梯度溶液，包括24%碘克沙醇中的样品。

7. 以50,000 g离心60分钟。

8. 以15-20个等体积分数收集梯度。

方法注释

均质化介质

通常用Tris、Hepes、Tricine或三乙醇胺(10-20 mM浓度)缓冲溶液，如果缓冲液的类型显著影响分馏，则不太可能。

如所述的工作溶液的制备，确保KCl, MgCl₂，EDTA, DTT和缓冲液(Hepes-KOH, pH 7.2)的浓度在整个梯度恒定。如果认为这一点不重要，可以简单地通过使用溶液B稀释OptiPrep™来制备碘克沙醇溶液。可根据操作者的判断将蛋白酶抑制剂包括在溶液B和C中。

裂解液的澄清

就刚地弓形虫而言，粗酸性钙体沉积在15,000 g而不是10,000 g。粗馏份的悬浮液应尽可能轻柔地进行，以避免不仅对所关注的细胞器，而且对存在的任何其他细胞器，特别是那些可能释放降解酶的细胞器造成损害。如果选择梯度样品的中位加载，而不是顶部加载，将颗粒悬浮在不超过2 ml的溶液B中，这样用溶液D调整密度后的体积仍然可以控制。

梯度格式（所有碘二醇浓度均为%（w/v））

在某些情况下，例如从盘状盘状盘状圆盘分离酸钙体时，省略了40%碘克沙醇层。为了避免由于在方案2c-1中样品/24%碘克沙醇界面处粒子的快速积累而造成的任何可能的材料损失，可能优选将粗颗粒悬浮在其中一个梯度层中。较低的密度层(15%和20%碘克沙醇)被包括在内，以提高收缩空泡从较致密的线粒体，糖体和溶酶体的分辨率;这种格式在需要更完全的分馏的任何研究中通常是有益的。

对于弓形虫，梯度包括10%、15%、20%(样品)、25%和30%碘克沙醇。在对酸性钙体的蛋白质组学分析研究中，Ferella等人使用了不连续的20-50% (w/v)碘克沙醇梯度，在对收缩液泡的类似研究中，不连续梯度由15、20、25、30、34、37和40%碘克沙醇组成，样品位于25%层。

形成不连续的梯度

虽然叠加(即从最密集的层开始)是最常见的创建不连续梯度的方法，但使用注射器和金属套管进行底层(即从最不密集的层开始)更可靠，也是制作不连续梯度的推荐方法。如有必要，调整所有体积比例，使管(样品应用后)根据制造商的说明适当填充。

分馏梯度

如果使用厚壁管，则从管底部或半月板(使用Labconco Auto Densi-flow装置)抽吸是可接受的获取梯度的方法。由于颗粒可能分散，用致密液体向上位移卸载可能难以接受。只要酸性钙体不形成太紧实的颗粒，薄壁管穿刺就可以满意。

分析

方案已被用于从克氏锥虫、布氏锥虫和利什曼原虫中分离酸性钙体，用于钙离子和磷酸盐代谢的研究。尽管糖体、溶酶体和空泡腔倾向于在样品和梯度层的顶部界面附近重叠，但该方案也允许一些其他细胞器的部分分解。

然而，不同生物体的细胞器在使用方案时的行为方式有相当明显的差异。碱性磷酸二酯酶在梯度的顶部显示明确的浓度;这是许多微生物收缩液泡的一个已确定的标记。液泡的条带密度始终低于任何其他细胞器。另一方面，焦磷酸酶和液泡型H+- atp酶(V-H+ atp酶)同时存在于液泡和致密的酸性钙体中，证实了这两种颗粒之间的功能联系。酸性磷酸酶(溶酶体)和琥珀酸细胞色素C还原酶(线粒体)各有其特点。线粒体的分布很广(与哺乳动物细胞的通常模式相比);然而，显示最高琥珀酸细胞色素C还原酶的组分8-10在其他细胞器的标记中也显著缺乏。同样值得注意的是，来自盘骨网的溶酶体比线粒体的大部分更致密(到目前为止所研究的所有哺乳动物细胞都是相反的)。

●在莱因衣藻的例子中，方案也能够非常清楚地分解一个酸钙体部分，在这种情况下，线粒体也在梯度的三分之一处被很好地分解，但叶绿体的分布相当广泛。

●方案对刚地弓形虫和克氏锥虫的液泡、溶酶体和糖体以及酸钙体提供了更清晰的分辨率，它们分别带向梯度的顶部、中部和底部。

●不连续的碘克沙醇梯度也被用于从盘骨藻中纯化收缩液泡。

 裂解液的澄清

从红色红螺旋体和肿瘤农杆菌提取的裂解物在1000g下澄清5 min。

 粗酸钙小体部分的制备

对于细菌14,500g被用于产生一个粗的细胞器组分。因此，为了最大限度地提高酸钙化小体的产量和纯度，可能有必要优化匀浆的差分离心法。

梯度格式（所有碘二醇浓度均为%（w/v）)

将细菌悬液(红色红螺旋菌和肿瘤农杆菌)调整为30%碘克沙醇，并使其成为24%、28%、30%、35%、40%碘克沙醇梯度的一部分。从马特鲁霍蒂棒状杆菌裂解液中提取14,500 g(10分钟)的组分，以24%、28%、30%、35%、40% (w/v)碘克沙醇梯度加载，作为30% (w/v)步骤的中位数，并在235,000 gav下离心1小时。颗粒在30%-35%界面条带。

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