【Serumwerk】从藻类和真菌中的细胞器（The organelles from algae and fungi）分离

主要用于分离酸性钙体的梯度也可分解线粒体。在25 mM KCl, 5 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0.5 mM EDTA, 10 mM Hepes, pH 7.2含0.1% NP40(加蛋白酶抑制剂)的条件下，可以从鞭毛脱落膜囊。然后通过16000 g重复离心10分钟去除轴突蛋白，并在228000 g离心30分钟后从上清液中收获囊泡。将1 ml培养基中的粗囊泡调整为15% (w/v)碘克沙醇;用等量的30%碘克沙醇柱，在431,000 g下离心约1小时。在梯度中间的囊泡带。

在一项关于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中Wood和Rosenbaum纤毛发育的研究中，将胞浆提取物调整为30% w/v碘克沙醇，并覆盖25%、20%、15%、12%、10%和5%的层，在20万g的浓度下离心3小时。梯度用于研究鞭毛发育过程中蛋白质在细胞质膜上的附着。

将含有1 mM EDTA的常规缓冲0.25 M蔗糖溶液中的LMF调整为35% (w/v)碘克沙醇和在近垂直NVT65转子中自生成的梯度，该梯度在202,000 g下离心4 h。如果收集线粒体和溶酶体的重叠部分，将其调整为25%碘克沙醇并重新离心，则可获得这两种细胞器的完全分离。

微管连接器

细胞在微管稳定培养基中溶解:1.2 M山梨醇，2 mM MgSO₄，2 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mM EGTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.2，含有50μM紫杉醇和0.1% BSA，外加蛋白酶抑制剂。将匀浆与等体积的10% (w/v)碘克沙醇混合在0.6 M山梨醇、2 mM MgSO₄、2 mM KCl、1 mM DTT、4 mM EGTA、10 mM Tris-HCl中，pH 7.2，含有10μM紫杉醇(加蛋白酶抑制剂)。以15%、25%和40% (w/v)碘克沙醇(分别为8 ml、8 ml和4 ml)为不连续梯度，在同一缓冲液中，覆盖15 ml 300 g上清液，以141,000 g离心30 min，微管连接细胞器在最低界面条带。

 聚磷酸盐空泡

Yagisawa等人从cyanidyzon merolae中分离了这些富含多磷酸盐的液泡，并鉴定了一些重要的蛋白质。作者使用的不连续梯度是一种不常见的梯度，包括三层，第一层为27%、62%和80% (w/v)碘克沙醇。为了实现后两种解决方案，作者首先通过蒸发OptiPrep™中的水来生产密度非常高的原液。出于安全原因，OptiPrep™制造商不能推荐这一操作。然而，由于液泡在27%/62%碘克沙醇界面条带，我们建议忽略最致密的层，并从OptiPrep™和27% (w/v)碘克沙醇形成梯度。为了保持作者使用的其他溶液性质，首先制备62% (w/w)蔗糖溶液的稀释剂，其中含有40 mM MgCl₂、100 mM KCl、400 mM Tris-HCl, pH 7.6。对于密集梯度溶液，将1 ml稀释剂添加到20 ml OptiPrep™中。由此制备27% (w/v)碘克沙醇溶液，用3.3 ml 0.25 M蔗糖、2 mM MgCl₂、5 mM KCl、20 mM TrisHCl、pH 7.6稀释2.7体积OptiPrep™。使用后者来重悬总膜颗粒。将0.6 ml该蛋白覆盖至2 ml致密溶液上并与1.4 ml溶解溶液覆盖并于50,000 g下于8℃离心1 h。液泡在较低的界面带。

（ Cryptococcus neoformans extracellular vesicles）

这种真菌的葡糖醛酸氧基甘露聚糖似乎在膜囊中被转运到细胞外空间。这一胞出过程类似于发生在哺乳动物细胞中的过程，用于纯化从这些细胞释放的EVs的浅6-18% (w/v)碘克沙醇梯度也被用于对新生隐球菌的类似研究。在250,000 g下将梯度离心75 min。葡萄糖醛酸氧基甘露聚糖和甾醇的复杂带型提示出芽囊泡的异质性。Wolf等使用了不连续的碘克沙醇梯度，其中包括3 ml 30%碘克沙醇和2 ml 25%、20%、15%和10% (w/v)碘克沙醇。5% (w/v)碘克沙醇的粗膜囊泡在顶部分层，并在4℃，140 000 g离心15小时。EVs的峰值发生在梯度的中点以下，有趣的是，最轻的囊泡缺乏葡萄糖醛酸氧基甘露聚糖。

溶液制备

A. OptiPrep™

B. OptiPrep™稀释剂:0.25 M蔗糖，10 mM EDTA, 100 mM MOPS-NaOH pH 7.2, 1% (v/v)乙醇

C. 54% (w/v)碘克沙醇原液:9体积溶液A + 1体积溶液B。

D. 均质培养基:0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM MOPS-NaOH, pH 7.2，含0.1% (v/v)乙醇。

E. 47%和35% (w/v)碘克沙醇梯度溶液:稀释溶液C与溶液D。

试验方法

1．在溶液D中制备氮浆匀浆。

2．以500 g将匀浆离心5 min并重复此操作3次以去除所有研磨粉及核。

3．将PNS在25,000 g下离心30 min制备粗制细胞器颗粒，并将颗粒重悬于溶液D中。

4．将重悬浮颗粒与等体积47% (w/v)碘克沙醇溶液混合。

5．将9-10 ml粗细胞器悬浮液转移到23.5%碘克沙醇中，用1-2 ml 35%碘克沙醇溶液下层。如有必要，通过在顶部分层溶液D将管子顶至所需的填充量。

6．11万g离心2小时。两种碘克沙醇溶液界面处的乙醛糖体带。

巴西副球虫(Paracoccidioides brasiliensis)酵母相中的线粒体和过氧化物酶体已使用与酿酒酵母(S. cerevisiae)制备线粒体相同的梯度进行分离。最密集的条带含有过氧化物酶体。

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