【Serumwerk】外周血单个核细胞（PBMC）分离——低密度碘二醇密度屏障
外周血单个核细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™（使用前轻轻摇动）
B. 稀释剂：0.85%（w/v）氯化钠，30 mM Tricine NaOH，pH 7.4（仅适用于工作溶液）
C. Tricine缓冲盐水（TBS）：0.85%氯化钠，10 mM，Tricine-NaOH，pH 7.4
试验方法
1．配制含40% (w/v)碘二醇的工作溶液:将4ml OptiPrep™与2ml Solution B混合。
2．将2.7 ml工作液加入10ml未稀释的全血中，调节全血血浆ρ = 1.095 g/ml左右。
3．用9.6 ml C溶液稀释5 ml工作溶液，制得ρ= 1.078 g/ml的密度屏障溶液。
4．用注射器和金属套管将5ml的密度屏障与5ml的血液放入15ml的离心管中。
5．层约0.5 ml的C溶液在上面，并在700 gav下在20°C下离心20分钟。
6．1.078 g/ml屏障顶部的PBMCs带。用移液器或注射器和金属套管除去带。保持Tricine为100 mM原液，4°C;每100毫升水含1.79克。将0.85 g NaCl溶于50 ml水中;加入30毫升或10毫升的Tricine原液(分别用于溶液B或溶液C);用1m NaOH调至pH 7.4，调至100ml
7．要使细胞成球，用等体积的C溶液稀释悬浮液，400 g离心10分钟。
方法注释
1．只要密度保持在1.006 g/ml左右，稀释剂的组成就可以根据操作员自己的要求进行调整。方案中使用了Tricine-NaOH缓冲液，但也可以替换任何合适的缓冲液。
2．OptiPrep™可直接与全血混合，但推荐使用含有40% (w/v)碘二醇(ρ = 1.216 g/ml)的缓冲工作液。
3．对该方法进行了一个微小的修改，其中血浆调整为1.1 g/ml而不是1.095 g/ml。这似乎有利于pbmc的恢复，但仅从那些红细胞密度较高的样品中。如果大部分红细胞浮至1.078 g/ml层底部，则PBMCs的回收率略差。
4．建议在1.078g/ml的层上分层少量的生理盐水:这有利于pbmc的收集，避免它们在水/空气界面上结扎。然而，它在任何方面都不是分离的关键。
5．Roos等人在深入研究了用于蛋白质组学分析的PBMC分离方法后报道，该方法的PBMC产率与标准密度屏障沉淀法一样好，且血小板污染最低。
6．如果淋巴细胞的污染不是问题，这种漂浮法有时用于单核细胞功能的研究。
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