【Serumwerk】酵母球质体中粗制线粒体部分分离
酵母球质体中粗制线粒体部分分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
酵母球质体中粗制线粒体部分分离
（The crude mitochondrial fraction in yeast spheroplasts）
溶液制备
A.球体缓冲液:1.2 M山梨醇，20 mM磷酸盐缓冲液，pH值7.4
B.球体溶解培养基:0.6 M山梨醇，20 mM MES-KOH, pH 6.0
球质体生产
该方案是为5 l培养的酵母细胞，即约35-40 g包装酵母细胞。
1. 每g细胞使用2.5 mg酶20T，并溶解于溶液A(每g细胞2 ml)中。
2. 用40 ml溶液A洗涤细胞并以2000 g离心5 min。
3. 除去上清液，将细胞颗粒悬浮于酶溶液中，30°摇匀孵育30 min。
粗线粒体生产
在0-4℃下执行所有操作。可根据需要按比例缩小该方案。
1. 将球体悬浮液以4000 g离心5 min。
2. 将来自约35 g湿重酵母细胞的球质体以40 ml /球质体颗粒悬浮于溶液A(盒1)中，并以4000 g离心5 min。
3.取出上清液，重复步骤1和2。
4. 将每个球质体颗粒重新悬浮于50 ml溶液B(盒1)中，并在密式Dounce均质器(惠顿a型)中使用舂槌15次均质。
5. 用溶液B (1.5体积)稀释匀浆，1500 g离心5 min，使细胞核和未破碎的细胞成球。
6. 滗出并保留上清液;由于颗粒可能是松散的包装，最好使用20毫升注射器和金属套管吸出上清液。
7. 将每个颗粒重新悬浮于溶液B中，重复步骤4-6。
8. 合并上清液并以12,000 g离心10分钟。
9. 将上清液滗出，并用宽松型(惠顿B型)Dounce匀浆机的舂棒轻轻敲打3-4下，将粗制线粒体颗粒重新悬浮于溶液B中。
10. 将悬浮液以1500 g离心5 min以去除任何聚集物和碎片。
11. 使用注射器和金属套管，仔细吸取上清液;重复步骤8并将颗粒重新悬浮于第3-5部分所述的溶液之一中。
梯度分析法
1. 用25 ml 1.2 M山梨醇、40 mM MES-KOH、pH 6.0稀释14.5 ml和18 ml 50% Nycodenz®原液，制备14.5%和18% (w/v)的Nycodenz®溶液，并用水将其配制至50 ml。
2. 在裂解培养基中重新悬浮粗制线粒体颗粒(约1毫升每10克原始酵母湿重)使用小体积宽松的Dounce匀浆机。
3.在13 ml管中(约13 ml管，例如Beckman SW 41Ti, Sorvall TH641或等效)，底层为6 ml含有相同体积18% Nycodenz®的14.5% Nycodenz®溶液，上层为1 ml粗提的线粒体悬浮液。
4. 20万gav离心30 min，从两种Nycodenz®溶液的界面收集线粒体;用约4-5体积的0.6 M山梨醇、20 mM HepesKOH、pH 7.4溶液C稀释悬浮液。将线粒体在12,000 g下颗粒化10分钟，并在相同的缓冲液中重新悬浮。
●如果这些Nycodenz®溶液的密度不合适，Glick和Pon建议调查以下替代方案15%和21%，14%和20%，13%和19%或12%和18% (w/v)。
Nycodenz® 产品信息
理化特性
●分子量：821 g/mol
●密度：2.1 g/ml
●溶于水浓度：80% (w/v)，溶于水密度：1.426 g/ml
稳定性和储存
●固体形式的Nycodenz®在室温和避光条件下可稳定保存2年。
产品特点
●非离子型，对细胞无毒，代谢惰性
●可用于细胞、亚细胞细胞器和膜、大分子和病毒的分离
●形成真正的溶剂。因此，分离后很容易从细胞中除去培养基
●能抵抗细菌降解
●溶液可以进行高压灭菌
使用方法
1. 通过离心在原位形成的(自形成渐变)。
2. 将所需浓度的溶液分层放入适当的离心管和允许的解决方案扩散。使用Nycodenz®等渗溶液梯度可以在45分钟内简单地准备好。
3. 冷冻和解冻。
4. 梯度混合器。
应用
Nycodenz®可用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白的分离。此外，在等渗或轻度高渗条件下，大多数类型的亚细胞器都可以在Nycodenz®的梯度上成功分离。Nycodenz®渗透压低，无毒，是分离完整活细胞的理想介质。Nycodenz®的低粘度及其非离子特性已经证明了Nycodenz®在病毒和细菌的分离和纯化方面是有用的。
可分离：
哺乳动物和非哺乳动物的细胞
亚细胞的细胞器
非哺乳动物来源的细胞器
亚细胞的膜
蛋白质和蛋白质复合物
核糖核蛋白
病毒
Nycodenz®可以通过透析、超滤或凝胶过滤从样品中去除。细胞、亚细胞细胞器和其他颗粒物质可以通过离心从Nycodenz®中分离出来，而不会有被Nycodenz®污染的风险。
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