【Serumwerk】内质网、高尔基体与其他细胞器分离（梯度改良方法）
内质网、高尔基体与其他细胞器分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 分离培养基:0.25 M蔗糖，10 mM HepesNaOH, pH 7.8
C. 稀释剂:0.25 M蔗糖，60 mM Hepes-NaOH, pH 7.4
D. 50% (w/v)碘克沙醇工作液(ρ = 1.272 g/ml): 5体积溶液A + 1体积溶液C
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。
1．用剪刀将肝切碎，然后在溶液B (4 ml/g肝)中使用宽松的Dounce匀浆器的杵击30下匀浆。
2．将匀浆以10,000 g离心20 min，使大多数较大的细胞器成球。
3．将10000 g上清液以100000 g离心40分钟，用Dounce匀浆机的舂杵敲20下，将微粒体颗粒重新悬浮在溶液B中(每2 g肝脏5.0 ml)。
4．将3体积微粒体悬浮液与2体积溶液D混合。
5．将4.5 ml转移到垂直转子管和底层1.8 ml 30% (w/v)碘克沙醇，由3体积溶液D + 2体积溶液B制成。
6．将约4.5 ml的15% (w/v)碘克沙醇(1.5体积的溶液D + 3.5体积的溶液B)铺在顶部以填充管。
7．以350,000 gav的速度离心2小时。
8．通过试管穿刺或从半月板抽吸，用密集的卸载溶液向上移位，以20×0.5 ml为单位收集梯度。
方法注释
如果不需要分离光滑和粗糙的内质网，那么高尔基体和内质网可以在一个简化的系统中分离。Yamaguchi等人将总微粒体调整为12.5% (w/v)碘克沙醇，并在一个接近垂直的转子(Beckman NVT65.2)中以365,000g离心2.5小时。ER在靠近梯度底部的地方条带，而高尔基体在梯度的中间和顶部呈双相。该方法已非常成功地用于多种细胞类型，包括星形胶质细胞、神经胶质瘤细胞、衣原体和COS细胞。
1．EDTA不包含在隔离介质中对于该方案的成功是很重要的。
2．蛋白酶抑制剂(PMSF，白细胞肽素，抗疼痛药，抑肽酶等)可根据操作者的判断包含在任何或所有介质中。
3．较小的体积转子，如NVT65.2(5毫升管)将需要或多或少相同的离心条件。可以使用固定角度的转子，但它需要是一个小体积、高性能的转子，才能在2小时内形成合适的密度梯度剖面。这种转子的梯度形成能力需要在使用前确认。
4．选择的管是Optiseal™管，这只适用于贝克曼转子。由于他们是密封的中央塑料加而不是热或卷曲密封，他们很容易使用，最重要的是，他们可以通过任何标准技术卸载的梯度，开放的顶部管摆动斗转子。
5．如果使用分离出的肝细胞，则允许它们在含有95% O2/5% CO2的培养基(例如DMEM)中“恢复”，在37℃下30分钟，然后在4℃ 800g下将细胞造粒2分钟。在冰冷的PBS中洗涤细胞，然后让它们在10 mM Hepes-NaOH中，pH 7.8的冰上膨胀5-15分钟。将细胞悬液调整为0.25 M蔗糖，然后在Dounce匀浆机中使用杵的30下进行匀浆。
6．可在3000g离心之前插入可选的1000g/10 min步骤。这可以防止大量快速沉降的核和碎片捕获许多较小的颗粒。
7．对于较小规模的制剂，将溶液D直接添加到10,000g上清液中可能令人满意。
8．体积较小的30%碘克沙醇垫用于防止游离核糖体和蛋白质到达管壁。
9．使用缓慢的加速和减速程序从2000转。
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