【Serumwerk】从培养的细胞中纯化细菌
从培养的细胞中纯化细菌不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
从培养的细胞中纯化细菌
溶液制备
作为密度屏障溶液，放置50 ml溶液A，其中含有0.26 M NaCl, 6 mM KCl, 0.6 mM CaNa2EDTA, 10 mM Tricine-HCl, pH 7.2，在150毫升烧杯上加热磁搅拌器设置约50℃并添加18 g少量NycodenzⓇ直至溶解。让溶液冷却到室温，然后用水配制多达100毫升。必要时进行过滤消毒。
试验方法
1. 用胰蛋白酶-EDTA在DMEM中正常暴露，使细胞单层分离。
2. 离心收集细胞，在含10% FCS的培养基中洗涤2次。
3. 将细胞悬浮在10倍稀释的磷酸盐缓冲盐水中，在Dounce匀浆器中通过匀浆破坏肿胀的细胞。
4. 在250 g下去除细胞碎片5 min，然后加入等体积的含0.4 M蔗糖的磷酸盐缓冲液来提高匀浆的渗透压。
5. 将悬浮液加载到含有0.13 M NaCl、3 mM KCl、0.3 mM NaCa2-EDTA、5 mM Tris-HCl、pH 7.2的18% (w/v) NycodenzⓇ溶液中，分别在超速离心机或高速离心机的摇桶转子中以35000 g离心40 min(或27000 g离心1 h)。
6. 从界面中获取基本体并在磷酸盐缓冲盐水中洗涤。
Nycodenz® 产品信息
理化特性
●分子量：821 g/mol
●密度：2.1 g/ml
●溶于水浓度：80% (w/v)，溶于水密度：1.426 g/ml
稳定性和储存
●固体形式的Nycodenz®在室温和避光条件下可稳定保存2年。
产品特点
●非离子型，对细胞无毒，代谢惰性
●可用于细胞、亚细胞细胞器和膜、大分子和病毒的分离
●形成真正的溶剂。因此，分离后很容易从细胞中除去培养基
●能抵抗细菌降解
●溶液可以进行高压灭菌
使用方法
1. 通过离心在原位形成的(自形成渐变)。
2. 将所需浓度的溶液分层放入适当的离心管和允许的解决方案扩散。使用Nycodenz®等渗溶液梯度可以在45分钟内简单地准备好。
3. 冷冻和解冻。
4. 梯度混合器。
应用
Nycodenz®可用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白的分离。此外，在等渗或轻度高渗条件下，大多数类型的亚细胞器都可以在Nycodenz®的梯度上成功分离。Nycodenz®渗透压低，无毒，是分离完整活细胞的理想介质。Nycodenz®的低粘度及其非离子特性已经证明了Nycodenz®在病毒和细菌的分离和纯化方面是有用的。
可分离：
哺乳动物和非哺乳动物的细胞
亚细胞的细胞器
非哺乳动物来源的细胞器
亚细胞的膜
蛋白质和蛋白质复合物
核糖核蛋白
病毒
Nycodenz®可以通过透析、超滤或凝胶过滤从样品中去除。细胞、亚细胞细胞器和其他颗粒物质可以通过离心从Nycodenz®中分离出来，而不会有被Nycodenz®污染的风险。
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