【Serumwerk】纯化刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）分离
纯化刚地弓形虫分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
纯化刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）分离
溶液制备
A. NycodenzⓇ粉末
B. OptiPrep™（使用前轻轻摇动）
C. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）
D. 仅适用于NycodenzⓇ溶液：磷酸盐缓冲液：100体积1.78%（w/v）Na2HPO4.2H2O+25体积1.38%（w/v）NaH2PO4.H2O
为了形成30% (w/v) NycodenzⓇ原液，将50 ml水置于置于加热的磁搅拌器上的150 ml烧杯中，设置为约。50℃并添加30 g少量NycodenzⓇ粉末直至溶解。使溶液冷却至室温;加入5毫升D溶液，然后用水配制至100毫升。如果需要，可进行过滤灭菌。对于连续梯度，用溶液c稀释30%的原液，制备10% (w/v) NycodenzⓇ的溶液。对于不连续梯度的替代方案，也制备类似的20% NycodenzⓇ溶液。
对于碘克沙醇选项，只需用溶液C稀释OptiPrep™(60% w/v碘克沙醇)，制成10%和30% 或 10%， 20%和30% (w/v)碘克沙醇溶液。
试验方法
1．在Vero细胞、CHO细胞或HFF中培养弓形虫。
2．使用双腔梯度发生器或gradient Master™从等体积的10%和30% NycodenzⓇ或碘克沙醇中制备连续梯度(15 ml管中总容积约8 ml或50 ml管中总容积约30 ml)。如果这两种装置均不可用，则从等体积的10%、20%和30% NycodenzⓇ或碘克沙醇制备不连续梯度;小心地将管旋转到水平位置，并通过扩散形成梯度。
3．在梯度生产过程中，从细胞培养上清中收获寄生虫，并通过27号注射器针头将悬液传递两次，以破坏任何污染的细胞。
4．用C溶液洗涤弓形虫3次;每次以1000 g将悬浮液离心10 min。
5．最后将颗粒悬浮于10% NycodenzⓇ或碘克沙醇中并在连续梯度之上分层。
6．大约在2000 g离心。30分钟。
7．收集1.09-1.11 g/ml的弓形虫(刚好在梯度的一半以上)。
方法注释
1. 30% (w/v) NycodenzⓇ溶液将具有轻度高渗透性(约315 mOsm);所有碘克沙醇溶液将与哺乳动物细胞等渗。
2. 在室温下，不连续梯度的扩散不应超过约1小时。如果管子保持垂直，整个过程将需要几个小时。由于弓形虫条带密度略低于20% (w/v) NycodenzⓇ或碘克沙醇，在纯化过程中不连续梯度可能是有效的，但尚未经过测试。
3. 颗粒上和颗粒中残留缓冲液将稀释梯度介质以允许在10-30%梯度上分层。如果在样品分层中遇到困难，用约0.2 ml溶液C稀释样品。
4. 不要用制动器来减速转子。
Nycodenz® 产品信息
理化特性
●分子量：821 g/mol
●密度：2.1 g/ml
●溶于水浓度：80% (w/v)，溶于水密度：1.426 g/ml
稳定性和储存
●固体形式的Nycodenz®在室温和避光条件下可稳定保存2年。
产品特点
●非离子型，对细胞无毒，代谢惰性
●可用于细胞、亚细胞细胞器和膜、大分子和病毒的分离
●形成真正的溶剂。因此，分离后很容易从细胞中除去培养基
●能抵抗细菌降解
●溶液可以进行高压灭菌
使用方法
1. 通过离心在原位形成的(自形成渐变)。
2. 将所需浓度的溶液分层放入适当的离心管和允许的解决方案扩散。使用Nycodenz®等渗溶液梯度可以在45分钟内简单地准备好。
3. 冷冻和解冻。
4. 梯度混合器。
应用
Nycodenz®可用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白的分离。此外，在等渗或轻度高渗条件下，大多数类型的亚细胞器都可以在Nycodenz®的梯度上成功分离。Nycodenz®渗透压低，无毒，是分离完整活细胞的理想介质。Nycodenz®的低粘度及其非离子特性已经证明了Nycodenz®在病毒和细菌的分离和纯化方面是有用的。
可分离：
哺乳动物和非哺乳动物的细胞
亚细胞的细胞器
非哺乳动物来源的细胞器
亚细胞的膜
蛋白质和蛋白质复合物
核糖核蛋白
病毒
Nycodenz®可以通过透析、超滤或凝胶过滤从样品中去除。细胞、亚细胞细胞器和其他颗粒物质可以通过离心从Nycodenz®中分离出来，而不会有被Nycodenz®污染的风险。
相关产品推荐
其他细胞品类
别划走，精彩继续
长按识别
添加一对一专属技术支持
扫码进群
咨询详细产品信息
点在看，传递你的品味
