【Serumwerk】间质细胞和亨利细胞的薄环分离

（Thin rings of interstitial and Henry cells）

溶液制备

A. NycodenzⓇ原液，28%（w/v），ρ = 1.15 g/ml（见方案步骤1）

B. 稀释剂：3mM氯化钾，0.3 mM CaNa₂-EDTA，5 mM Tricine-NaOH，pH 7.4

C. 7.45%（w/v）蔗糖，5 mM，pH 7.4

试验方法

1．使原液将约50 ml溶液B放入150 ml烧杯中，放在约50℃的加热磁力搅拌器上，少量加入28 g NycodenzⓇ直至溶解。50℃，少量加入28 g NycodenzⓇ直至溶解。让溶液冷却至室温，然后用溶液b配制至多100 ml。如有需要，可用过滤器进行消毒。

2．用C溶液稀释28%的NycodenzⓇ溶液，得到8%和20%（w/v）的NycodenzⓇ溶液。

3．在15 ml离心管层中，2ml 8% NycodenzⓇ超过3ml 20% NycodenzⓇ溶液，并通过扩散形成连续的梯度。

4．将粗细胞悬液置于上面，1500g离心45 min。

5．允许转子在不制动的情况下减速。

6．间质细胞带在1.081-1.093 g/ml，相当于大约15-17%的NycodenzⓇ。在同样的梯度中，Henle细胞的细肢主要带在1.052-1.069 g/ml，约相当于9.4%-12.5% NycodenzⓇ。

7．使用注射器和金属套管恢复适当的图层，或以一系列等体积分数卸载梯度。       

方法注释

1．其他一些已发表的论文也报道了使用这种方法分离大鼠肾近端小管细胞。然而，对缓冲区和渐变都有一些小的修改。Schaaf等使用含管道的Hank 's平衡盐溶液(HBSS)，而不是HEPES;这些工人还将细胞悬浮在14% (w/v) NycodenzⓇ中，而不是11.3% NycodenzⓇ和9% NycodenzⓇ中，而不是6.8% NycodenzⓇ。

2．Kruidering等人从猪中获得细胞，使用含177 mM葡萄糖、10 mM NaHCO₃、15 mM KCl、42 mM K2HPO4、15 mM KH2PO4和2 mM甘氨酸的灌注培养基(Eurocollins, pH 7.4)。在这种情况下，切碎的皮质用含有25 mM HEPES和2 mM甘氨酸的无Ca²⁺/Mg²⁺ HBSS洗涤。在添加了4 mM CaCl₂和1 mM去铁胺的相同HBSS溶液中，用0.07%的胶原酶将切碎的组织分解。密度梯度差异较大，分别为8.5% (5 ml)、11.3% (10 ml)和17% (w/v) NycodenzⓇ(5 ml);所述细胞位于11.3% NycodenzⓇ层中。离心时间6 min，近端小管细胞从上界面回收。

3．目前尚不清楚在这些分离中碘克沙醇是否可以取代NycodenzⓇ。当然，它作为无菌60% (w/v)溶液(OptiPrep™)的可用性将使溶液制备更容易。

4．保持NycodenzⓇ作为40% (w/v)的无菌原液在水中是一个方便的来源，用于制备广泛的梯度。使库存溶液放置约。将50毫升水放入150毫升烧杯中，置于加热的磁搅拌器上，设置为约为100毫升。50℃并添加40 g少量Nycodenz直至溶解。让溶液冷却到室温，然后用水配制多达100毫升。必要时进行过滤消毒。

5．该6.8% NycodenzⓇ溶液具有约1.037 g/ml之密度。

6．在每次离心后，以最小的剪切力进行细胞重悬。

7．不要使用刹车来减速转子。

8．虽然Tris被用作缓冲液，但在本申请表中已替换了更“细胞友好”的Tricine。约用作NycodenzⓇ原液稀释剂的蔗糖等渗溶液(溶液C)具有约1.28 g/ml的密度。鉴于蔗糖对哺乳动物细胞的已知毒性，一种变体可能是使用具有相同密度的4.5% (w/v) NycodenzⓇ等渗溶液。用任何正常的缓冲盐水稀释溶液A即可产生。

9．在管被盖上并旋转到水平位置后，允许发生扩散。

10．还可使用梯度卸载装置，例如贝克曼分数回收系统。

理化特性

●分子量：821 g/mol

●密度：2.1 g/ml

●溶于水浓度：80% (w/v)，溶于水密度：1.426 g/ml

稳定性和储存

●固体形式的Nycodenz®在室温和避光条件下可稳定保存2年。

●非离子型，对细胞无毒，代谢惰性

●可用于细胞、亚细胞细胞器和膜、大分子和病毒的分离

●形成真正的溶剂。因此，分离后很容易从细胞中除去培养基

●能抵抗细菌降解

●溶液可以进行高压灭菌

1. 通过离心在原位形成的(自形成渐变)。

2. 将所需浓度的溶液分层放入适当的离心管和允许的解决方案扩散。使用Nycodenz®等渗溶液梯度可以在45分钟内简单地准备好。

3. 冷冻和解冻。

4. 梯度混合器。

Nycodenz®可用于核酸、蛋白质、多糖和核蛋白的分离。此外，在等渗或轻度高渗条件下，大多数类型的亚细胞器都可以在Nycodenz®的梯度上成功分离。Nycodenz®渗透压低，无毒，是分离完整活细胞的理想介质。Nycodenz®的低粘度及其非离子特性已经证明了Nycodenz®在病毒和细菌的分离和纯化方面是有用的。

可分离：

哺乳动物和非哺乳动物的细胞

亚细胞的细胞器

非哺乳动物来源的细胞器

亚细胞的膜

蛋白质和蛋白质复合物

核糖核蛋白

病毒

Nycodenz®可以通过透析、超滤或凝胶过滤从样品中去除。细胞、亚细胞细胞器和其他颗粒物质可以通过离心从Nycodenz®中分离出来，而不会有被Nycodenz®污染的风险。

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