【Serumwerk】光学系统膜和结构（Optical system membranes and structures）隔离

浏览量：116

Serumwerk Bernburg AG

Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

光学系统膜和结构隔离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

视网膜棒外节段（ROS）和ROS盘分离

（Retinal rod outer segments (ROS) and ROS disks）

溶液制备

A. OptiPrep™

B. 林格液:130 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl₂, 1.2 mM CaCl₂, 0.02 mM EDTA, 10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4

C. 裂解缓冲液:2 mM Tris-HCl, pH 7.4

试验方法

1．用溶液B将8 ml溶液A稀释到100 ml，制成8% (v/v)的OptiPrep™溶液。

2．将12只小鼠视网膜悬浮于0.12 ml该溶液中。

在室温下执行此和以下步骤。

3．涡旋1 min，然后以200 g离心1 min。

4．小心地回收上清液(不干扰颗粒)并保留。

5．将颗粒重新悬浮于0.12 ml 8% OptiPrep™溶液中，并重复步骤3-4。

6．重复这个过程五六次。

7．将1 ml和3 ml溶液A分别用溶液B稀释至10 ml，配制10%和30% (v/v)的OptiPrep™梯度溶液。

8．使用双腔梯度发生器或Gradient Master™从这两种溶液中制备10- 12ml的连续梯度，并将其装在用于摇桶转子的管中。

9．将合并的上清液分层(约1.5 ml)置于顶部，以26,500 g离心30 min。

10．收集ROSs的条带(大约从梯度顶部的三分之二处)。

11．用3体积的B溶液稀释，500 g离心3分钟，将细胞核打成颗粒。

12．通过在26,500 g下离心30 min来收获ROSs。

13．制备条带时，将ROSs悬浮在2 ml溶液C中，并在0℃下保持15 h。

14．从1.5 ml和4 ml溶液A中分别配制15%和40% (v/v) OptiPrep™梯度溶液，用溶液B分别稀释至10 ml。

15．使用双腔梯度发生器或Gradient Master™从这两种溶液中制备10- 12ml的连续梯度，并将其装在用于摇桶转子的管中。

16．将溶解的ROSs置于梯度上方并以26,500 g离心30 min。

17．收获的条带约三分之二的方式从顶部的梯度。

方法注释

均质介质和梯度溶液

Optiprep™应用中所有碘克沙醇溶液均通过使用Ringers溶液稀释Optiprep™制备，这意味着KCl、MgCl₂、CaCl₂、EDTA和缓冲液的水平将降低。如果认为在所有密度溶液中保持这些水平是重要的，那么应首先用1体积的130 mM NaCl, 21.6 mM KCl, 14.4 mM MgCl₂，7.2 mM CaCl₂，0.12 mM EDTA, 60 mM Hepes-NaOH, pH 7.4稀释5体积的Optiprep™，制备50% (w/v)碘克沙醇的工作溶液。因此，工作溶液中KCl, MgCl₂，CaCl₂，EDTA和Hepes的浓度将与林格斯缓冲液相同。使用林格氏缓冲液进行进一步稀释，然后需要在方案中给出的浓度基础上进行适当调整，以得到正确密度的梯度溶液。注意，如果稀释剂中NaCl的浓度也升高，那么50% (w/v)碘克沙醇的渗透压将会高到不可接受的程度。

梯度制备

如果这两种梯度制造装置都不可用，则可以通过扩散不连续梯度来制备连续梯度。例如，10-30% (v/v) Optiprep™梯度(步骤7)可能由10%、18%、24%和30% Optiprep™等量的不连续梯度产生。同样，15-40% (v/v)的Optiprep™梯度(步骤14)可能由15%、21%、27%、33%和40% Optiprep™等量的不连续梯度产生。

梯度和离心格式的变化

连续梯度连续碘二醇梯度通常符合上述方案，尽管Peshenko等使用20-30%（v/v）Optiprep™梯度和更高的重力75000g，持续40 min。

不连续梯度

常用的不连续梯度格式涉及将提取的ROSs在8% (v/v) Optiprep™中分层超过10%和18% (v/v) Optiprep™的两个层;然而，离心条件略有不同:3,300 g 10 min，50,000 g 1 h，70,000 g 1 h。梯度层密度的变异包括8.3%和20%，6.7%的样品，仅在1,425 g离心15 min。梯度包括3层:10,20和30%(样品含量8%)，17000 g离心50 min后，ROSs在20%/30%界面和4层:8%，12%，16%和20%(样品含量2%)。

感光器外节段（POS）分离

（Photoreceptor outer segments (POS)

Jiang等和Hazim等描述了在130 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl₂，1.2 mM CaCl₂，0.02 mM EDTA和10 mM HEPES中均匀化视网膜，pH值7.4；然后在100 g离心1 min后，上清液在8、10和15% (w/v)碘克沙醇上分层，并在12000 g离心20 min。Pelkonen等人在一个有趣的变化中描述了8%碘克沙醇(在碳酸氢盐缓冲液中)匀浆组织。在720 g初始离心3 min(重复5次)后;将悬浮液稀释到2%碘克沙醇，并在10%和20%的碘克沙醇上分层，在14000 g下30分钟显带POS。

相关产品推荐