【Serumwerk】细小病毒（Parvovirus）纯化
细小病毒纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
不连续梯度法
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 10x磷酸盐缓冲盐水，含10 mM MgCl2和25 mM KCl (10xPBS-MK)
C. 含1 mM MgCl2和2.5 mM KCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS-MK)
D. 2 M氯化钠溶液
E. PBS-MK中54% (w/v)碘克沙醇工作液:将9体积OptiPrep™与1体积溶液B混合。
试验方法
1．准备以下梯度溶液:
15% (w/v)碘克沙醇含1 M NaCl的PBS-MK溶液:1.5体积溶液E + 2.7体积溶液D + 1.2体积溶液C。
25% (w/v)碘克沙醇PBS-MK: 2.5体积的溶液E + 2.9体积的溶液C
40% (w/v)碘克沙醇PBS-MK: 4.0体积的溶液E + 1.4体积的溶液C。
2．通过4,000 g离心20 min澄清的细胞裂解物。
3．下层10-15 ml澄清的裂解液，加入9 ml 15%碘克沙醇;6 ml 25%碘克沙醇，5 ml 40%碘克沙醇和5 ml 54%碘克沙醇工作溶液。使用长金属套管(0.8 mm i.d)连接到注射器或通过管子连接到蠕动泵来装填管子。
4．以350,000 gav在18℃离心1小时。如果离心机上有此设备，请使用缓慢的加速和减速程序(最高和低于2000转/分)，或在减速期间关闭低于2000转/分的刹车。
5．首先收集整个梯度的1-2 ml密集分数，或者使用插入40%/ 54%界面的注射器抽吸4mL的40%层。
方法注释
1．较小容量的转子可以替代。对于较小的体积管，按比例缩小所有体积。
2．微小病毒与细胞裂解液中蛋白质的聚集可对其分离造成严重问题，因为聚集物是异质性的，因此表现出广泛的密度。在15%碘克沙醇中加入1 M NaCl可防止这种聚集，并使病毒在40%/54%碘克沙醇界面以上以单一条带分离。
3．交替的梯度层中可包括酚红(0.01µg/ml)，以辅助分层过程。
4．如果要用大量的溶液来建立这种梯度，使用蠕动泵引入碘克沙醇溶液会使这一任务更容易。
5．用5 ml样本层将密度梯度减少到总体积6 ml。15万g(较长时间)之较低g-力可减少粒子及蛋白质之任何界面聚集。
6．在25%/40%碘克沙醇界面，裂解产物条带中所有的污染蛋白。
7．离子交换、亲和层析、细胞孵育或SDS-PAGE可以直接对含碘克沙醇的部分进行。只有电子显微镜检查可能需要去除碘克沙醇。
自生成的碘二醇梯度
Hendrie等使用自制碘克沙醇梯度纯化细小病毒。通过冻融，在常规Tris缓冲盐水中溶解细胞，并在4100 g下去除细胞碎片30 min后，将上清液调整为1 M NaCl。然后将其与OptiPrep™混合至36% (w/v)的最终碘克沙醇浓度，在290,000 g下离心3 h。所有操作均在4℃下实施。病毒在约1.29 g/ml处形成条带。
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