【Serumwerk】布氏锥虫——糖核小体（Trypanosoma brucei —— glyconucleoomes）分离
糖核小体分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 均质培养基:0.25 M蔗糖，1mM EDTA, 0.1% (v/v)乙醇，5 mM Mops pH 7.2。
C. 6 mM EDTA, 0.6%乙醇，30 mM mop, pH 7.2。
D. 1 M蔗糖。
E. 梯度溶液:由溶液A、C、D和分别使用的水组成，这些体积比例:
E1: 5 + 0.6 + 0.4 + 0.0(50%碘克沙醇)
E2: 4 + 0.6 + 0.7 + 0.7(40%碘克沙醇)
E3: 2 + 0.6 + 1.1 + 2.3(20%碘克沙醇)
根据需要在溶液中添加蛋白酶抑制剂。溶液A也可以用作锥虫的洗涤介质；当用于此目的时，溶液中可以省略蛋白酶抑制剂。
试验方法
在0-4℃下执行所有操作
1．借由以100 g离心15min去除碳化矽。
2．滗出上清液并以1000 g离心15分钟，使细胞核成球。
3．滗出上清液并以17000 g离心15分钟，得到粗糖体颗粒。
4．滗出并丢弃上清液，用宽松的Dounce匀浆器(惠顿B型)的杵轻轻敲击几下，将颗粒重新悬浮在大约3 ml的溶液B中。
5．在差速离心过程中，使用双腔梯度发生器或梯度大师将16 ml梯度溶液E2和E3分别放入垂直转子管中制备线性梯度，每层梯度溶液E1为3.5 ml。将第4步的悬浮液转移到梯度的顶部，以170,000 g离心1小时。如果有条件，使用缓慢加速和减速程序;或者从2000转/分开始减速时关闭刹车。
6．收获纯化的糖体，这些糖体在梯度中形成最密集的条带，或以若干等体积分数卸载梯度。
方法注释
1．如果将制备物缩小到更小的管(13 ml)，则使用Beckman VTi65.1或Sorvall 65V13转子。如果没有垂直转子可用，则可以使用摆动桶转子，但需要增加离心时间，以考虑较长的路径长度。
2．贝克曼转子的Optiseal管是最容易装卸的密封管。
3．对于较小的体积，转子按比例缩放所有梯度和样品体积。
4．Gualdron-López等人使用20%-35%的连续梯度v/v OptiPrep™(有50%的v/v OptiPrep™垫)，在垂直转子中以100,000 g离心2小时。随后将离心时间延长至15 h。
伸缩泡（Contractile vacuole）分离
将一系列低速离心的上清液以100,000 g离心1 h，重悬颗粒以15%、20%、25%、30%、34%、37%和40% (w/v)的不连续梯度加载中位数(25%碘克沙醇)。以50,000 g 65 min离心;收缩液泡在梯度顶部附近带状分布。
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