【Serumwerk】外周血单个核细胞（PBMC）分离——沉降法
外周血单个核细胞分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
EDTA(终浓度1.5-2.0 mM)是首选抗凝剂。
A. OptiPrep™ (60%, w/v iodixanol)
B. 生理盐水溶液：0.85%（w/v）氯化钠，10mM Hepes（或Tricine），pH 7.0-7.6。使用前轻轻摇晃OptiPrep™瓶，使用5体积OptiPrep™+17体积溶液B填充密度屏障。
试验方法
1. 静脉穿刺采集人血，加入合适的抗凝剂;例如，将10ml血液与150 ml的100mm二钾EDTA轻轻混合。然后用等体积的B溶液稀释。
2. 将3ml的屏障溶液输送到15ml的锥形管中；然后将6ml稀释后的血液铺在上面。为了获得一个锋利的界面，倾斜管子并从连接到金属填充套管的10ml塑料注射器中输送血液。
3. 在20°C下，700 g离心20分钟。
4. 从接口获取PBMC
方法注释
1. 任何平衡的盐溶液或培养基都可以作为溶液B。
2. OptiPrep™非常粘稠；当将等分液吸进自动移液器时，慢慢地将等分液排出到混合容器中。
3.只有全血用生理盐水稀释才能获得高产量(95%)的PBMC。对于未稀释的血液，产率降低到85%，因为样品和血液之间的界面培养基不太稳定，血细胞有“流”过培养基的趋势，携带红细胞和单核细胞进入颗粒。
4. 宽口径不锈钢填充套管(直径约0.8毫米)很容易从手术设备供应公司获得。通过倾斜导管并将导管尖端置于密度屏障上方1-2 cm，可以维持或多或少连续的血流，从而产生一个尖锐的界面。
5. 允许使用更大体积的稀释血液(例如8- 9ml)，但可能需要增加大约离心时间5分钟;样品顶部的细胞将暴露在比3+ 6ml格式更低的重力下。在50毫升的试管中，使用10毫升屏障和20毫升稀释后的血液。
6. 建议在800 g下进行淋巴细胞分离20分钟;有了这个碘二醇屏障，700克就足够了;淋巴淋巴细胞中多糖的存在使溶液更粘稠，因此推荐的g力更高。
7. 在4°C时，分离可以同样有效地进行，但可能需要增加5分钟的离心时间，以克服较低温度下密度屏障粘度的略微升高。
8. 不要使用制动器使转子减速。转速的快速变化在液体中产生涡流，使颗粒和带状细胞“旋转”。将Hepes(游离酸)或Tricine作为100 mM的原液保存在4°C；每100ml水2.38g Hepes或1.79g Tricine。溶液B:将0.85g NaCl溶于50 ml水中;加入10毫升Hepes或Tricine原液;用1m NaOH调至pH 7.4，调至100ml。
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