【Serumwerk】细胞和组织中纯化：突触体、突触神经体、神经黑色素颗粒和突触囊泡的制备

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

突触体、突触神经体、神经黑色素颗粒和突触囊泡的制备不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

突触体

Kiebler等是第一个描述使用间断碘克沙醇梯度从小鼠海马分离树突棘的小组。梯度为9%、12.5%、15%和25% (w/v)碘克沙醇(相当于1.076、1.095、1.105和1.152 g/ml) 4层;密度最大的溶液含有从海马匀浆中提取的900 g 10 min的物质。梯度离心18000 g 20 min，称为速度浮选分离。梯度的主要目的是分离树突棘，在二级percoll -蔗糖梯度中进一步分离在9%/12.5%界面条带的材料。

基本方法随后被用于分离突触体。Bagni等人是第一个报道这种方法的小组，他们颠倒了Percoll和碘克沙醇浮选梯度的顺序。在15- 23% Percoll界面的材料通常用于后续的碘克沙醇梯度纯化，通常修改为包括35% (w/v)碘克沙醇的密集层，离心条件更改为10,000 g 20分钟。在15%/25%碘克沙醇界面的突触体带。基本上，其他工作者也使用了同样的方法。

Troca-Marín等用40%碘克沙醇中的粗馏份使梯度下分层以纯化突触神经体，Heintz等最近也使用了这一方法。

Yuan等人只使用0-30% (w/v)碘克沙醇梯度分析海马组织，结果显示神经丝蛋白与突触体结合。Tenga等人使用类似的2.5% -30% (w/v)碘克沙醇梯度(约120,000 g作用18 h)分割小鼠前额叶皮质材料，确定UBXN2A与ER/顺式高尔基体共分割，而不是在突触体。

神经黑色素

将1,000 g/20 min的颗粒重悬于20% (w/v)碘克沙醇中，并在26%、31%、36%和50%碘克沙醇的不连续梯度上分层，并在81,000 g下离心3 h。在26% ~ 31%碘克沙醇界面出现神经黑素颗粒条带。

突触泡（Synaptic vesicles）分离

不连续浮选梯度

Hu等人首先描述了使用碘克沙醇梯度纯化由差速离心法分离的突触小体制备的突触囊泡。将synaptosomes渗透性溶解，通过34000 g离心20 min去除更快的沉降囊泡。然后将轻膜悬浮液与等体积的OptiPrep™(最终碘克沙醇浓度为30% w/v)混合，并在140 mM葡萄糖酸钾、4 mM MgCl₂、20 mM HEPES中覆盖24%碘克沙醇，pH值为7.3。在小体积(5 ml)固定角度转子中500,000 g离心1 h后，从24%碘克沙醇层的顶部回收SV。Ferraci也采用这种方法。Richards 将其放大到Beckman SW28摇摆桶转子，在95,000 g离心17小时;在hepes缓冲盐水(HBS)中制备24%碘克沙醇，并在其上加一层HBS。在最后的浓缩步骤中，将SV悬浮液与等体积的80% Nycodenz®混合;在20000g下离心8 h。重要的是，Holt等人比较了简单不连续的碘克沙醇浮选梯度和早期的蔗糖梯度+尺寸排除控制孔玻璃珠法，发现两种制备方法在突触囊泡和蛋白脂质体之间的融合实验中给出了非常相似的数据。与Hu等人所介绍的类似的间断浮选方法已被用于监测突触小泡的突触短蛋白含量以及突触结合蛋白在其胞吐和胞吞中的作用。

不连续的沉降梯度

来自裂解突触体的低密度膜囊泡也在类似的碘克沙醇梯度上得到纯化，碘克沙醇梯度顶部装载样品，而不是底部装载。低密度膜组分在145 mM NaCl, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES-KOH, pH 7.4中在5%，10%，15%和20%碘克沙醇的相同缓冲液中分层。14万g离心16小时(Beckman SW28转子)后，SV在5%/10%碘克沙醇界面条带。

连续沉降梯度

weble等人使用坐骨神经匀浆作为突触囊泡的来源，在1000 g的初始离心10分钟后，在10% (w/v)的蔗糖缓冲液(100,000 g)中第二次离心1小时，从上清液中去除细胞溶质蛋白。通过3次15%或30% (w/v)碘克沙醇冻融循环产生连续的碘克沙醇梯度。重悬膜在梯度上分层，在200000 g离心3小时。梯度在区分低密度神经营养成分囊泡和致密突触囊泡方面非常有效。在一项确定突触囊泡物理参数的研究中，Takamori等将囊泡加载到5-35% (w/v)碘克沙醇梯度上;18万g离心5 h，中位密度为1.09 g/ml。

自生成梯度

使用任何自生成梯度的最大优点是易于样品处理(简单地将样品调整到碘克沙醇所需的起始浓度)，以及在特定的离心参数组下梯度密度剖面的高度可重复性。碘克沙醇能够在1-4小时内形成有用的自生梯度，这取决于离心速度和转子。最广泛使用的转子是垂直或接近垂直的转子，其管尺寸约3、5或13毫升，能够产生至少265,000 gav的力。近垂直转子比垂直转子有一个优势，因为任何材料的颗粒被限制在管的底部在一个近垂直转子，而在一个垂直转子这样的颗粒分布在整个长度的管的最外层点。梯度的形状主要由离心时间和重力决定。一般情况下，短时间离心(1小时)后的梯度是s形的，在管的中部非常浅；随着离心时间的增加，梯度变得更线性，尽管在高密度区域的梯度总是变得更陡峭。4-5小时后，梯度达到平衡位置，碘克沙醇分子向沉积物的趋势被它们沿梯度向下扩散所抵消。Hashiramoto和James在研究脂肪细胞葡萄糖转运囊泡时首先使用了自生成梯度;他们能够从低密度膜囊泡制剂中分离出两种不同的含有GLUT-4的囊泡群。

Ferguson等人采用了同样的策略，即从突触体中制备突触囊泡。将所述馏分调整为14% (w/v)碘克沙醇并且在垂直转子中以265,000 g离心4 h并且鉴定出富含胆碱转运体的低密度馏分。类似的自生成碘克沙醇梯度也被用于分析果蝇头部的囊泡。在梯度Syt-1突触小泡与其余的突触结合蛋白明显结合。

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