【Serumwerk】细胞和组织中纯化：从嗜酸性粒细胞中分离出一个颗粒部分

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Serumwerk Bernburg AG

Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

从嗜酸性粒细胞中分离出一个颗粒部分不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

溶液制备

A. 均质培养基:0.25 M蔗糖，1 mM EGTA, 2 mM MgCl₂，10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4

B. OptiPrep™稀释剂:0.25 M蔗糖，6 mM EGTA, 60 mM Hepes- NaOH 7.4

C. 50%碘克沙醇工作液:5体积OptiPrep™与1体积溶液B混合

D. 梯度溶液:45% (w/v)碘克沙醇；将4.5体积的溶液C与0.5体积的溶液A混合

请注意，在使用之前，溶液A也可以调整到1 mM ATP。蛋白酶抑制剂可以包含在A-C方案中。

试验方法

细胞制备

从新鲜人血液(抗凝剂EDTA)制备多形核白细胞(PMNs)，但在4℃下进行离心。可能需要增加离心时间以允许在较低温度下增加液体粘度。将从梯度收集的PMNs在缓冲盐水中洗涤和重悬，然后使用免疫磁珠通过阴性选择纯化嗜酸性粒细胞。Anti-CD16可清除中性粒细胞;anti-CD14和anti-CD3将清除任何残留的单个核细胞。使用免疫磁珠对嗜酸性粒细胞进行阴性选择已成为首选方法。然而，在随后分离常密度和低密度嗜酸性粒细胞时，仍使用简单的不连续梯度。

颗粒分离

在4℃下执行所有步骤

1. 用溶液A洗涤细胞2次，然后在该溶液中悬浮嗜酸性粒细胞;通常，在约使用5×10⁷嗜酸性粒细胞。1×10⁷细胞/毫升。

2. 在600 psi下通过氮气空化10分钟使细胞均质化。

3.以200 g将匀浆离心10 min。

4. 使用双腔梯度发生器或Gradient Master™，从4 ml溶液A和5 ml溶液D中为SW41转子准备梯度。最后加入0.5 ml溶液D。

5. 将200 g上清液置于梯度上(每个梯度约2 ml)并以100,000 g离心1小时。允许转子使用缓慢减速程序减速或在2000 rpm以下关闭制动器。

6. 通过导管穿刺、向上移位或从半月板抽吸的方法收集梯度0.5 ~ 1.0 ml。

方法注释

溶液

在碘克沙醇梯度的内质网、质膜和高尔基体分析中，在均质培养基中添加无机盐(含K⁺或Na⁺离子)变得越来越普遍；它可以减少离子相互作用，膜之间的聚集和对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。Levi-Schaffer等人在匀浆前将溶液A调整为2mM MgCl₂和1 m ATP，用于嗜酸性粒细胞的最终悬浮液，以增强颗粒功能活性的保留。

核后上清的均质化和产生

滚珠轴承均质器或“细胞裂解器”，与标准0.3747在(9.52 mm)滚珠轴承，现在被视为最有效和可复制的设备之一;LeviSchaffer采用氮气空化，Spencer采用氮气空化。如果这两种装置都没有，但通过注射器针头(测量号(G)从21到26不等)的10-20通道可以是一个有效的替代方案，但在使用它作为颗粒制备的替代方案之前，必须测试其有效性。理想情况下，操作应尽可能温和和可重复，目的是造成至少95%的细胞破坏，而不破坏主要细胞器，特别是细胞核和溶酶体。Neves等使用1 ml细胞悬液。

Neves等人将来自步骤3的颗粒重悬浮于1ml溶液A中;重复空化和200 g离心(步骤3)，将两种上清液合并。在早期方法中，第一次低速离心在400 g下进行10 min。

密度梯度

较早的Nycodenz®将低密度梯度溶液梯度为2% (w/v)并且允许的替代方案是在该方法中使用2% (w/v)碘克沙醇(由溶液D (2体积)和溶液A (43体积)的混合物制备该溶液。如果梯度的顶部是0% (w/v)碘克沙醇，则核后上清液可能难以分层，因此2%低密度溶液可能更可取。如果两种梯度制造装置都不具备，则可以通过扩散从不连续的梯度产生连续的梯度:使用1ml 2%(或0%)和等体积的5%、15%、25%、35%、40%和45% (w/v)碘克沙醇。同样值得注意的是使用一种非常简单的不连续梯度，将来自HL60细胞的核后上清液与等体积的致密溶液(ρ = 1.12 g/ml)混合，并在14 ml的1.05 g/ml溶液和5 ml的1.12 g/ml溶液之间分层。两种密度约相当于19%和4% (w/v)碘克沙醇。将梯度在37,000 g下仅离心35 min以纯化嗜天青颗粒。

密度分析

在约1.20 g/ml浓度时，颗粒带靠近梯度的底部，而胞质蛋白仍位于梯度的顶部。在离心时间较短的条件下，可溶性蛋白仅在离样品层较短的距离内沉积和扩散。质膜也将带靠近梯度的顶部。Spencer等人通过光学和电子显微镜以及主要碱性蛋白和CD63染色在流式细胞术分析中确认了颗粒部分的身份和纯度。作者能够证明颗粒内存在预先形成的细胞因子受体。本方法中描述的碘克沙醇梯度是等渗的，不可能使Nycodenz®具有类似的渗透性质，这被认为是碘克沙醇梯度具有独特的能力，能够从颗粒中溶解嗜酸性粒细胞囊泡的原因。

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