【Serumwerk】细胞和组织中纯化：从不同来源分离出囊泡状和颗粒状组分

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

从不同来源分离出囊泡状和颗粒状组分不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

肾上腺嗜铬细胞（And adrenal chromaffin cells）均质化

梯度方法描述了0.3 M蔗糖，1mM MgSO₄，1mM EDTA和10 mM HEPES (pH 7.0)的均质培养基。从含有50% (w/v)碘克沙醇的原液制备梯度溶液:将OptiPrep™用0.3 M蔗糖、6mM MgSO₄、6mM EDTA和60 mM HEPES (pH 7.0)稀释5∶6 v/v。之后均质介质中加入10 mM KCl;因此，OptiPrep™稀释剂含有60 mM KCl并且蔗糖浓度降低至0.25 M(以保持等渗浓度)。在梯度之前，标准差速离心1000 g 10分钟以去除细胞核，随后10,000 g 20分钟将颗粒(大而致密的核心囊泡)制成颗粒是大多数方法的共同方法。因此，颗粒的主要污染物是线粒体;大部分(但不是全部)溶酶体和其他较小的细胞器将留在上清液中。早期梯度是不连续的，包括8%和16%或8%和18% (w/v)碘克沙醇溶液;离心条件为100,000 g 1 h或10,000 g 10h。最近，8-26% (w/v)碘克沙醇连续梯度离心10万g 1小时(样品应用于5%碘克沙醇)，使颗粒部分到达管的底部。另外有方法在110,000 g下离心15-16 h。

淋巴细胞（leukomonocyte）均质化

通常已在含有8-27% (w/v)碘克沙醇的梯度中实施含有颗粒酶B和/或颗粒溶素的裂解颗粒的分离，在150,000 g下离心5h。均质化后，将淋巴细胞悬液的核后上清液在18,000 g下离心20 min，产生轻+重线粒体部分，并在碘克沙醇梯度中进行分析。从8、12、16、19、22.5和27% (w/v)碘克沙醇构建梯度，样品中位数装载在19% (w/v)碘克沙醇层。在离心过程中，梯度或多或少会变成线性。颗粒溶素在梯度的中位和最密集条带中强烈富集。与顶部加载相比，中间加载有一个明显的优势：在后者中，所有的粒子都在沉降，而在前者中，一些粒子将沿着梯度向上移动，另一些则向下移动，从而提高了粒子的分辨率。Kozlowski等以较低的g-力(100,000 g持续2h)使用略有不同的6-30% (w/v)碘克沙醇连续梯度。

嗜中性粒细胞和HL60细胞（Neutrophils and HL60 cells）均质化

HL60细胞在含0.3 mM EDTA的hepes缓冲的0.25 M蔗糖培养基中匀浆，并与等体积碘克沙醇(1.12 g/ml密度)混合;在等体积的1.05 g/ml溶液与5 ml的1.12 g/ml溶液之间分层。在37000 g离心35分钟后，嗜天青颗粒(由联胶蛋白鉴定)主要在下界面周围条带。

神经黑色素颗粒（Neuromelanin granules）均质化

将人大脑突触体释放的神经黑素颗粒调整为20%碘克沙醇，按不连续的26%、31%、36%和50%碘克沙醇梯度分层，在81,000 g离心3h后，颗粒在20-26%的界面上条带。

腮腺腺泡细胞（Parotid gland acinar cells）均质化

从大鼠腮腺释放含淀粉酶颗粒，在常规等渗的Trisbuffered 0.25 M蔗糖溶液中匀浆。核后上清液在连续的10-30% (w/v)碘克沙醇梯度上分层(通过匀浆培养基稀释OptiPrepTM制备的溶液)，并在137,000 g下离心2小时:颗粒在20% (w/v)碘克沙醇周围条带。

血小板（blood cells）均质化

氮空化是最有效的血小板均质化方法。血小板在145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO₄，10 mM葡萄糖，0.5 mM EGTA, 25 mM Hepes-NaOH, pH 7.4中进行匀浆。由5体积OptiPrep TM和1体积145 mM NaCl, 30 mM KCl, 6 mM MgSO₄，60 mM葡萄糖，3 mM EGTA, 25 mM Hepes-NaOH, pH 7.4制备50% (w/v)碘克沙醇工作溶液。用均质介质进行进一步稀释。将空穴调整为11% (w/v)碘克沙醇，转移到用于摆动桶转子的离心管中，并用30% (w/v)碘克沙醇溶液作为基础。在38000 g离心3 h后，收集界面带并透析以去除碘克沙醇。从1%、15%、20%、25%和30% (w/v)碘克沙醇各2 ml制备第二梯度;透析样品(约2.5 ml，含约2 mg蛋白质/ml)在顶部分层并以38,000 g离心3小时。允许转子从2000转/ min开始减速，无需制动(或使用受控减速程序)。如果分离仅基于密度，那么这是一个有效的替代方案;另一方面，如果分离是基于沉降率，那么这种方法是无效的。25%/30%界面处出现α-颗粒带。

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