【Serumwerk】细胞和组织中纯化：从胰腺细胞中提取分泌颗粒的分离

A. OptiPrep™

B. 均质培养基:0.3 M蔗糖，1 mM K EDTA, 1 mM MgSO₄, 10 mM MES-NaOH, pH 6.5

C. OptiPrep™稀释剂:0.3 M蔗糖，6 mM KEDTA, 6 mM MgSO₄, 60 mM MES-NaOH, pH 6.5

D. 50%碘克沙醇工作溶液:溶液A的5体积+溶液C的1体积

在0-4℃下执行所有操作。

1．使用滚珠轴承均质器将溶液B中的单元均质化。

2．将匀浆500 g离心10 min并保留核后上清液(PNS)。

3．用体积比为8:42和19:31的溶液D和B配制8%和19% (w/v)碘克沙醇各20 ml。

4．使用双腔梯度制作器或梯度MasterÔ制作一个近似。从等体积的8和19%碘克沙醇溶液管中梯度12 ml，用于摆动桶转子。

5．将PNS层置于梯度上，以160,000 gav离心16小时。

6．通过导管穿刺、向上移位或从半月板抽吸的方法收集梯度0.5 ~ 1.0 ml。

均质化介质

匀浆培养基(HM)通常必须根据组织或细胞类型进行定制。最常见的渗透平衡剂是0.25 M蔗糖，但略高的浓度(如本方案中的浓度)也很常见。在均质培养基和OptiPrep™稀释剂(溶液C)中使用0.3 M蔗糖。在碘克沙醇梯度的内质网、质膜和高尔基体分析中，用无机盐(含K+或Na+离子)补充HM变得越来越普遍;它可以减少离子相互作用，膜之间的聚集和对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。只能通过实验评估OptiPrep™应用表中报告的馏分是否可从此类修改中获益。二价阳离子的包含通常可防止核断裂并稳定膜，但在某些情况下可导致聚集。工作溶液的制备确保了EDTA, MgSO₄和缓冲液的浓度在整个梯度过程中保持恒定。如果认为这一点不重要，可以简单地用溶液B稀释OptiPrep™来制备碘克沙醇溶液。溶液C中的蔗糖浓度不应与其他组分一样增加6倍。如果是，工作溶液将是严重高渗的。可根据操作者的判断将蛋白酶抑制剂包括在溶液B和C中。

均质化

Dounce(有时是Potter-Elvehjem)均质化曾经是最广泛使用的程序，但滚珠轴承均质器或“细胞裂解器”，与标准的0.3747 in (9.52 mm)滚珠轴承，现在被认为是最有效和可复制的设备之一。如果这是不可用的，但是通过注射器针头的10-20通道(压力表编号(G)从21到26不等)通常是一个有效的替代方案。有时，如本研究方案中所示，通过在一半的注射过程中更换另一根更细的注射器针头，可以提高该方法的疗效。

偶尔使用注射器针头前会先进行Dounce匀浆。理想情况下，操作应尽可能温和和可重复，目的是造成至少95%的细胞破坏，而不破坏主要细胞器，特别是细胞核和溶酶体。

密度梯度制备

如果这两种梯度制造装置都不可用，那么可以通过不连续梯度的扩散来制备连续梯度(使用等体积的8%、12%、16%和20% (w/v)碘克沙醇)。应用这种技术从其他细胞中分离颗粒成分可能需要修改梯度的密度范围。

梯度分析

线粒体和溶酶体都很好地从向管底部形成的陡峭梯度中的颗粒部分中溶解。颗粒部分仅恢复2%的溶酶体和0.9%的线粒体。虽然最初形成的连续梯度本质上是线性的，但由于碘克沙醇分子本身的沉降(即会发生某种程度的自生)，在这种纯化的RCF和时间上，管的顶部和底部的梯度总是会出现一些锐化。请注意，线粒体在碘克沙醇中比在Percoll®中更密集;这就解释了两种培养基中溶酶体和线粒体带型的差异。

利用碘克沙醇梯度，Buchanan等人更全面地研究了这些颗粒的功能和性质，并鉴定了一种参与调节葡萄糖介导的胰岛素分泌的新肽。小鼠胰岛β细胞中含有胰岛素的大密核囊泡的条带位置与β tc6 - f7细胞的胰岛素颗粒相似，靠近溶酶体和线粒体，但分离良好。Varadi等还鉴定了含有细胞质膜(PM)和高尔基体的区域，这些区域分布在梯度的低密度区域。只观察到含有胰岛素的囊泡与较密集的高尔基体膜有明显重叠。核内体靠近梯度的顶部。各非颗粒膜室的条带变化与其他工作者观察到的情况基本一致，即密度依次为核内体、PMN、高尔基体、溶酶体、线粒体、线粒体、胞浆、胞浆、胞浆、胞浆、胞浆和胞浆。ER的密度低于PM和高尔基体;通常情况恰恰相反。Varadi等人在含有胰岛素的大的致密核心囊泡中发现了ATP敏感性钾通道的SUR1和Kir6.2亚单位，并发现肌球蛋白Va参与了分泌性囊泡的转运。Buchanan et al描述的碘克沙醇初始梯度也被Jurczyk用于研究胰岛β细胞分泌胰岛素颗粒。Cooper的一篇综述包括对不同方法分离的颗粒的观察。最近Chen等使用8.8%，13.2%，17.6%，23.4%和30% (w/v)碘克沙醇的不连续梯度，顶部负载的样品在100,000 g离心75分钟。颗粒在17.6%层的顶部和下方条带;密度较大的颗粒为较成熟的。

沉降速度分离

虽然大多数的分馏是基于颗粒的浮力密度实现的(有证据表明，这种分离在超过6 h时更有效)，但如果所研究的函数相当不稳定，则需要非常短的离心时间的交替沉降速度策略可能具有优势。Cao等人在0.3 M蔗糖，1 mM EDTA, 1 mM MgSO₄，10 mM me - koh, pH 6.5中匀浆INS-1E胰岛素瘤细胞，并在30%，23.4%，17.6%，13.2%和8.8% (w/v)碘克沙醇(10 ml总体积)的不连续梯度上分层PNS，并在100,000 g离心75分钟。使用梯度表明PICK1与胰岛素颗粒共定位，条带约在渐变的中间。

胰腺外分泌细胞（Exocrine cells of the pancreas）分离

胰腺外分泌肿瘤细胞的分泌颗粒也已从较轻的ER和10-30% (w/v)碘克沙醇梯度(137,000 g作用2小时)的细胞质中分离出来，在小体积转子(0.2 ml PNS加2 ml梯度)中分离。最近已经从培养的胰腺外分泌细胞中分离出颗粒，颗粒采用0-30% (w/v)碘克沙醇梯度，20,000 g离心3 h。颗粒呈条状分布于梯度的下半部分，在高密度端有一个尖峰;β-D木糖处理后，细胞条带向低密度方向增宽。

胰岛细胞（Islet cells）分离

8-20% (w/v)碘克沙醇梯度，约160,000 g离心。16小时后表明胰岛细胞高尔基体中胰岛素颗粒的产生是由前激素VGF调节的。

相关产品推荐