【Serumwerk】细胞和组织中纯化：一个大型蛋白质复合物的胞质或细胞膜位置的测定
一个大型蛋白质复合物的胞质或细胞膜位置的测定不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 均质培养基:0.25 M蔗糖，90 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)2,20 mM Hepes-KOH, pH 8.0
C. 稀释剂:540 mM KOAc, 12 mM Mg(OAc)2, 120 mM Hepes- KOH, pH 8.0。
D. 工作溶液(50%碘克沙醇):5体积溶液A与1体积溶液C混合。
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。
1．将溶液B中的细胞在细胞裂解器(滚珠匀浆器)中匀浆，使用4-6代。通过相差显微镜监测均质化的效果。
2．将匀浆以1000 g离心5 min以使细胞核成球。
3．将2体积核后上清液(PNS)与3体积溶液D混合。
4．以约350,000 gav离心1小时。
5．通过导管穿刺、用致密介质向上移位或从半月板抽吸0.5 ~ 1 ml去除梯度。
方法注释
均质介质和梯度溶液
通常必须将均质培养基裁剪成组织或细胞类型并且不知道HM的组成是否与分离相关。介绍了有机渗透平衡剂如蔗糖、甘露醇和山梨醇在亚细胞膜功能研究中的相容性；此外，这些低离子强度的HMs和梯度溶液允许直接使用馏分进行SDS-PAGE。虽然0.25 M蔗糖与Tris, Hepes, Tricine或三乙醇胺(在10-20毫米浓度)缓冲，含有1毫米EDTA仍然是一种广泛使用的HM，补充无机盐是越来越常见的，可以减少离子相互作用，膜之间的聚集和对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。一些不含蔗糖的培养基完全使用氯化钠(例如140毫米)或氯化钾或两者作为主要的渗透平衡剂。HM的组成也应与任何后续分析过程兼容。二价阳离子的加入可以防止核破裂;一般稳定膜，但可能导致聚集。
这些策略最初是为简单的HMs设计的，如0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM Hepes-KOH, ph值7.4。稀释5体积的OptiPrep™与1体积的0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 60 mM Hepes-KOH, pH.7.4产生50%的碘克沙醇溶液，含有与HM相同的浓度EDTA和缓冲液，或多或少等渗，因此，当与HM稀释时，所有溶液也将包含这些相同的浓度，也等渗。由于OptiPrep™本身表现为等渗溶液，因此不需要提高OptiPrep™稀释剂中的渗透平衡剂浓度。然而，在显著较高的浓度下(例如溶液B中的90mm)包含额外的组件会略微损害该策略。从OptiPrep™和溶液C制备50% (w/v)碘克沙醇工作溶液(WS)，确保当添加到PNS时，KOAc, Mg(OAc)₂和缓冲液的浓度不会改变，但渗透压将略有提高。只有实验才能确定哪一个更重要——保持KOAc浓度还是渗透压常数。Nürnberger等人首先用1/10体积的900 mM KOAc, 20 mM Mg(OAc)₂，200 mM Hepes-KOH, pH 8.0稀释OptiPrep™，制备54% (w/v)碘克沙醇溶液。
均质化
均质化方案应根据细胞(或组织)类型量身定制。Potter-Elevhjem组织匀浆和Dounce细胞匀浆曾经是标准程序。对于通过27或25号注射器针头传代5-15次的细胞，有时在此之前进行Dounce匀浆，这是比较常见的。滚珠轴承均质器(“细胞裂解器”)现在被广泛认为是最有效和可重复的设备之一。理想情况下，操作应尽可能温和和可重复，目的是造成至少95%的细胞破坏，而不破坏主要细胞器，特别是细胞核和溶酶体。均质化过程的类型和严重程度将对细胞器的完整性产生影响。
分析
Grindstaff等证明了质膜蛋白E-cadherin在未接触和分化的MDCK细胞中几乎只分布在梯度顶部的膜上的1-2部分。另一方面，Sec6/8复合体的位置从接触初始细胞中的仅胞质位置改变为分化细胞中的主要膜结合位置。该方案也被用于检测MDCK细胞中位于胞膜的Rac1:效应物复合体和位于胞质的GFP标记的Sec3融合蛋白。在一项关于在极化的上皮细胞中与连环蛋白和n -钙黏蛋白形成倒位蛋白复合物的研究中，用倒位蛋白抗体对梯度部分进行免疫印迹检测，发现140 kDa的蛋白以低水平广泛分布在梯度中，而125 kDa的蛋白仅在低密度膜部分中检测到，此外还有Pan-cadherin和β-catenin。在Triton X-100处理的稳定转染的LLC-PK1细胞的线粒体后上清中，网格蛋白涂层成分几乎局限于细胞质部分，而在表达转染μ1B的细胞中，网格蛋白成分以及Sec8, Exo70和AP-1B货物分子TfnR位于低密度的膜部分，而AP-1A货物分子furin仍然位于高密度的细胞质区域。
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