【Serumwerk】细胞和组织中纯化：膜囊泡和细胞质的自生成梯度分离

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Serumwerk Bernburg AG

Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

膜囊泡和细胞质的自生成梯度分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

溶液制备

酵母

A. OptiPrep™

B. OptiPrep™稀释剂:2.4 M山梨醇，6 mM EDTA, 120 mM四乙基乙酸铵，pH 7.2。

C. 工作液(50%碘克沙醇):5体积的OptiPrep™与1体积的溶液B混合。

D. 裂解缓冲液:0.4 M山梨醇，1 mM EDTA, 20 mM四乙基乙酸铵，pH 7.2。

哺乳动物细胞

E. OptiPrep™

F. OptiPrep™稀释剂:0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 120 mM Hepes-NaOH, pH 7.4

G. 工作液(50%碘克沙醇):5体积的OptiPrep™与1体积的溶液B混合。

H. 均质缓冲液:0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4

试验方法

在0-4℃下执行所有操作。

1．将球质体裂解物或细胞匀浆以1000 g离心5 min以去除细胞核和未破碎细胞。

2．去除上清液并通过与溶液C或G(分别为1 + 4体积)混合调整到40% (w/v)碘克沙醇。

3．用溶液D(或H)稀释溶液C(或G)，制备35% (w/v)碘克沙醇溶液;将0.9 ml置于用于超速离心固定角度转子的管中，并将其与核后上清液置于40%碘克沙醇中。

4．转移到超速离心机固定角度转子和离心机在100-120,000转3小时。

5．大约使用自动移液器或Labconco自动密流分馏器卸载梯度。0.1 ml。

方法注释

准备方案

如果溶液D(或H)含有低浓度的其他试剂(如DTT或MgOAc)，则可将这些试剂以6倍正常浓度纳入OptiPrep™稀释剂(溶液B或F)中。因此，50% (w/v)碘克沙醇工作溶液(溶液C或G)和用溶液D或H稀释产生的所有梯度溶液将含有与溶液D或H相同浓度的试剂。根据操作者的决定，蛋白酶抑制剂可包括在溶液B、D、F和H中。

哺乳动物细胞的均质培养基和梯度溶液

通常必须将均质培养基裁剪成组织或细胞类型并且不知道HM的组成是否与分离相关。介绍了有机渗透平衡剂如蔗糖、甘露醇和山梨醇在亚细胞膜功能研究中的相容性;此外，这些低离子强度的HMs和梯度溶液允许直接使用馏分进行SDS-PAGE。虽然0.25 M蔗糖与Tris, Hepes, Tricine或三乙醇胺(在10-20毫米浓度)缓冲，含有1毫米EDTA仍然是一种广泛使用的HM，补充无机盐是越来越常见的，可以减少离子相互作用，膜之间的聚集和对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。一些不含蔗糖的培养基完全使用氯化钠或氯化钾或两者作为主要的渗透平衡剂。HM的组成也应与任何后续分析过程兼容。二价阳离子的加入可以防止核破裂;一般稳定膜，但可能导致聚集。如果需要低渗培养基使细胞膨胀以达到充分的均质化程度，则重要的是尽快将均质物恢复到等渗状态。

均质化

均质化方案应根据细胞(或组织)类型量身定制。Potter-Elevhjem组织匀浆和Dounce细胞匀浆曾经是标准程序。对于通过27或25号注射器针头传代5-15次的细胞，有时在此之前进行Dounce匀浆，这是比较常见的。滚珠轴承均质器(“细胞裂解器”)现在被广泛认为是最有效和可重复的设备之一。理想情况下，操作应尽可能温和和可重复，目的是造成至少95%的细胞破坏，而不破坏主要细胞器，特别是细胞核和溶酶体。均质化过程的类型和严重程度将对细胞器的完整性产生影响。

离心法

采用这种小的沉降路径长度转子，很有可能将离心时间缩短到2h，而不会严重影响梯度的分辨率。最大转速为100,000 rpm的转子可能需要稍长的离心时间，但这些短路径长度的转子在较低的RCF下3小时后，梯度形成和颗粒条带应是令人满意的。

分析

胞质蛋白将保持在负载区，而膜囊泡将带在梯度的上半部分。

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