【Serumwerk】细胞和组织中纯化：膜结合蛋白和胞质蛋白的分离（通过不连续梯度的浮选）

类型I

A. OptiPrep™

B. 均质培养基:0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4

C. OptiPrep™稀释剂:0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 60 mM Hepes- NaOH, pH 7.4

D. 50% (w/v)碘克沙醇工作液(ρ = 1.272 g/ml): 5体积溶液A + 1体积溶液C

类型II

A. OptiPrep™

B. 均质介质:130 mM KCl, 25 mM NaCl, 1 mM EGTA, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4

C. OptiPrep™稀释剂:130 mM KCl, 25 mM NaCl, 6 mM EGTA, 150 mM Tris-HCl, pH 7.4

D. 50%碘克沙醇工作溶液:溶液A的5体积+溶液C的1体积

在0-4℃下执行所有操作。

如果使用梯度从通透化细胞中分离出有芽囊泡或细胞质囊泡，则在微离心机中或在低速离心机中以1000 g离心5 min从含囊泡的悬浮液中去除细胞，并使用上清液进行步骤3。

1. 将洗涤过的细胞悬浮于溶液B中，通过Dounce匀浆，通过细注射器针头或滚珠轴承匀浆器重复传代来破坏它们。

2. 将匀浆以1000 g离心15 min并抽吸上清液。

3.将上清液调整为30% (w/v)碘克沙醇，与溶液D充分混合(体积比分别为2:3)。

4. 用溶液B(体积比为1:1和1:9)稀释溶液D，制备含25%和5% (w/v)碘克沙醇的溶液。

5. 在用于摆动桶转子的管道中，在30%碘克沙醇和25%碘克沙醇中各加入2 ml粗囊泡，并通过叠加5%碘克沙醇填充管道。

6. 大约250,000 g离心3小时，收集在顶部界面和底部含有胞质蛋白的囊泡。或者通过导管穿刺、向上移位或从半月板抽吸的方法收集梯度0.5 ml /次。

哺乳动物细胞的解决策略

推荐的溶液是用于培养细胞和组织匀浆化的通用溶液。通常必须根据组织或细胞类型对均质培养基进行裁剪，但HM的组合物不太可能与本OptiPrep™应用程序表中所述的分离相关。有机渗透平衡剂，如蔗糖(I型)，因其在亚细胞膜功能研究中的相容性而被引入;此外，这些低离子强度的HMs和梯度溶液允许直接使用馏分进行SDS- PAGE。最常用的等渗HMs含有0.25 M蔗糖缓冲液与Tris, Hepes, Tricine或三乙醇胺(10-20 mM浓度)，通常(但不总是)含有1 mM EDTA或EGTA。用无机盐补充HM变得越来越常见，可以减少离子相互作用，膜之间的聚集，并对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。一些不含蔗糖的培养基(Ⅱ型)完全使用NaCl或KCl或两者作为主要的渗透平衡剂。通常需要一种明显低渗的培养基来使细胞膨胀，从而促进均质化。

在利用梯度分离出有芽囊泡或由培养细胞通透性释放的细胞质囊泡时，可使用特殊的溶液。140mm KCl, 10mm Hepes-KOH, pH 7.2的溶液分别含有2 mM EGTA和1 mM DTT或2.5 mM Mg(OAC)₂，分别用于产生芽囊泡或通透性细胞的囊泡。使用OptiPrep™稀释剂制备工作溶液(溶液D)，确保EDTA、EGTA和缓冲液等试剂的浓度在整个梯度恒定。

在OptiPrep™稀释剂中，蔗糖、KCl或NaCl等渗透压平衡剂的浓度不会以类似方式升高；如果是的话，溶液就会高渗。如果认为维持恒定的EDTA, EGTA和缓冲液浓度不重要，梯度溶液可以直接从OptiPrep™制备。可根据操作者的判断将蛋白酶抑制剂包括在溶液B和C中。

均质化

Dounce(有时是Potter-Elvehjem)均质化曾经是最广泛使用的程序，但滚珠轴承均质器或“细胞裂解器”，与标准的0.3747 in (9.52 mm)滚珠轴承，现在被认为是最有效和可复制的设备之一。如果这是不可用的，但是通过注射器针头的10-20通道(压力表编号(G)从21到26不等)通常是一个有效的替代方案。有时，这种方法的有效性可以通过切换到第二个更细的注射器针头来提高。偶尔使用注射器针头前会先进行Dounce匀浆。

理想情况下，操作应尽可能温和和可重复，目的是造成至少95%的细胞破坏，而不破坏主要细胞器，特别是细胞核和溶酶体。均质化过程的类型和严重程度将对细胞器的完整性和细胞质中由管状结构产生的囊泡的大小产生影响。因此，膜带在任何后续梯度中的模式可能不容易预测。

差速离心

虽然1000g离心可以去除细胞核，但没有明显的理由说明为什么3000g离心不能去除一些线粒体。

准备好不连续的梯度

与所有的浮选方法一样，在密度屏障的顶部总是放置小体积的缓冲液或5-10%的碘克沙醇，以防止囊泡在气/液界面处被束缚。后者常导致颗粒粘附到管壁和聚集。有时用裂解缓冲液代替5%碘克沙醇层。

收集从梯度中得到的分数

使用注射器和金属套管(内径约0.8 mm)仔细抽吸，可以将小的容积梯度简单地分为四个区域中的三个;可使用自动移液管，但应切断移液管尖端的末端以扩大孔。

哺乳动物细胞

通过这种浮选策略分析的一些细胞和组织，梯度格式和离心条件列在下表中。除非区分不同密度的囊泡很重要，否则没有明显的理由说明为什么从细胞质中分离总膜囊泡需要超过三层。在对NRK细胞出芽囊泡的分析中，Joglekar等(2003)顶部负载7%，50%的不连续梯度(100,000 g 40分钟)，然后去除含有胞质蛋白的顶层;在5-25% (w/v)连续碘克沙醇梯度下混合剩余并分层，以100,000 g离心90 min以分离ER和高尔基。我们使用2%和50% (w/v)碘克沙醇(100,000 g作用1 h)的顶部负载的不连续梯度来确定IL-32几乎完全是膜结合的。

细菌

De Leeuw等人设计了一个基本相似的策略来从大肠杆菌中分离膜和可溶性蛋白部分。将500 mM KOAc, 5 mM Mg(OAc)₂，50 mM HepesKOH, pH 7.6的膜颗粒与0.25 M蔗糖，50%碘克沙醇在相同的缓冲液(体积比为0.15:1.05)混合，覆盖5.8体积的125 mM蔗糖，30%碘克沙醇在相同的缓冲液和3体积的缓冲液。将梯度在166,000 g下离心3 h。

酵母（Yeast）均质化

虽然在大多数情况下，酵母细胞是通过球体形成的方式进行均质化，但偶尔也会使用玻璃珠进行均质化，所用的裂解缓冲液为150 mM NaCl、5 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH 7.4。将澄清的裂解产物调整为40% (w/v)碘克沙醇，覆盖30%碘克沙醇，裂解缓冲液在55,000 g下离心2 h。Medkova等人在20 mM三乙醇胺-乙酸盐缓冲液中制备球形质体裂解产物，pH 7.2，含有0.8 M山梨醇和1 mM EDTA，在10,000g下澄清10 min。将裂解产物调整为40% (w/v)碘克沙醇，覆盖35%碘克沙醇。碘克沙醇溶液在相同的缓冲液中含有0.4 M山梨醇和1 mM EDTA，梯度在100000 g的小体积固定角转子(Beckman TLA120.2)中离心3小时。Medkova在裂解液中包括50 mM MES, pH 6.5和20 mM MES在35%碘克沙醇溶液中以稳定膜蛋白结合。虽然山梨醇是酵母菌裂解物的常见成分，但它绝不是普遍包括在内的。Wang使用与Ge等相同的NaCl/EDTA缓冲溶液。通过简单添加一半体积的Optiprep™，将裂解产物调整为40% (w/v)碘克沙醇，覆盖30%碘克沙醇和裂解缓冲液，并在小体积Beckman TLS55转子中以200,000 g离心5 h。更复杂的不连续碘克沙醇梯度也已使用；将球质体裂解液调整为37% (w/v)碘克沙醇，分层置于30%、25%、19%、0%碘克沙醇之下，在75,000 gav下离心4小时，分离细胞质和空泡成分。在gradient Master™中从等体积的裂解培养基(400mM蔗糖，100mM NaCl, 20mM HEPES pH7.2)产生连续梯度，并在Beckman SW41旋盘中以190,000 g将裂解产物(调整为27% w/v碘克沙醇)离心16 h。它从密度较大的膜中分离出低密度溶解的液泡膜和梯度底部的可溶性细胞溶质蛋白。

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