【Serumwerk】内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离——不连续梯度沉淀法
内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 均质培养基:0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4
C. 稀释剂:0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 60 mM Hepes-NaOH, pH 7.4
D. 50% (w/v)碘克沙醇(ρ = 1.272 g/ml)工作液：5体积溶液A +1体积溶液C
试验方法
在0-4℃下执行所有操作(步骤1中磷酸盐缓冲盐水冲洗除外)。
1．用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，去除培养液，再用匀浆洗涤细胞1次，然后在匀浆中复悬。
2．将细胞悬浮在小体积均质培养基(0.5-5.0 ml)中，通过Dounce均质，通过细注射器针头或滚珠均质器重复传代来破坏细胞。
3．以1500 g将匀浆离心10 min。可将颗粒重悬于匀浆介质中;重复离心，必要时将两种上清液合并。
4．将上清液以65,000 g离心1小时，然后将颗粒重新悬浮于1-2 ml溶液B中。
5．将2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%和30% (w/v)碘克沙醇溶液各10 ml，混合溶液B和D的适当体积。
6．摆斗转子管中:2.5%、5%、7.5%、10%各2 ml, 12.5%、15%各0.5 ml, 17.5%、20%、30%各0.5 ml。
7．将囊泡悬液(0.8-1.0 ml)置于梯度上，20万gav离心2.5 h;允许转子在没有刹车的情况下从2000转减速。
8．通过导管穿刺或向上移位收集梯度0.5 ml /次。
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