【Serumwerk】细胞和组织中纯化：从细胞和组织中纯化脂筏（无洗涤剂法）
从细胞和组织中纯化脂筏不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 分离培养基:0.25 M蔗糖，1 mM CaCl₂，1 mM MgCl₂，20 mM Tris-HCl, pH 7.8
C. OptiPrep™稀释剂:0.25 M蔗糖，120 mM Tris-HCl, pH 7.8
D. 工作液(50%碘克沙醇):5体积的OptiPrep™与1体积的溶液C混合
E. 工作溶液稀释剂:0.25 M蔗糖，20 mM Tris-HCl, pH 7.8
F. 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
试验方法
除步骤3中的PBS洗涤外，在0-4℃下执行所有操作。
1. 从2体积的溶液D和3体积的溶液E中制备20% (w/v)的碘克沙醇溶液。
2. 使用双腔梯度发生器或gradient Master™在用于摆动桶转子的管中，从等体积的20%碘克沙醇和溶液B中制备8-9 ml梯度，并保持在4℃。
3.用PBS洗涤单层细胞1次，用B溶液洗涤2次;然后将细胞刮入溶液B中。
4. 将细胞颗粒置于250 g中2 min，然后将细胞颗粒重新悬浮于1 ml溶液B中。
5. 通过22G注射器针头将细胞匀浆20代。
6. 以1000 g将匀浆离心10 min。
7. 仔细抽吸并保留上清液。
8. 将颗粒重悬于1ml B溶液中，通过22G注射器针重复匀浆。
9. 将悬浮液以1000 g离心10 min。
10. 抽吸上清液，将混合的上清液与等量的溶液D混合。
11. 使用注射器和金属套管将密集的样品填充在梯度上。
12. 52,000 g离心90分钟。
13. 通过导管穿刺，用致密介质向上移位或从半月板抽吸，收集约0.5-0.75 ml的梯度，并根据需要分析分数。
方法注释
均质介质和梯度溶液
Macdonald and Pike和Pike分别用上述溶液处理CHO细胞。同样的策略也用于HeLa细胞。我们还从肾刷状缘膜和神经母细胞瘤细胞中制备了不含洗涤剂的脂筏组分。均质化介质类型与该技术疗效的相关性尚不清楚。如所述的工作溶液的制备，确保缓冲液的浓度在整个梯度中是恒定的，而蔗糖和碘克沙醇作为渗透平衡剂，以维持常数同渗浓度。
蛋白酶抑制剂如PMSF、白细胞肽素、抗疼痛药、抑肽酶等应包括在所有介质中。
形成梯度并加载样品
如果这两种装置都不可用，则可以通过不连续梯度的扩散来制备连续梯度。溶液B和5%、10%、15%、20%碘克沙醇的体积相同。在非去垢剂制备刷状缘膜和神经母细胞瘤细胞的木筏时，梯度是不连续的而不是连续的。使用带金属套管的注射器(内径约0.8 mm)可以形成不连续的梯度，并使梯度与样品形成下层。。
均质化
对于一些悬浮培养的细胞，可能需要使用较小规格的针(27G或25G)。滚珠轴承均质器(“细胞裂解器”)现在被广泛认为是最有效和可重复的设备之一。选择合适的装置需要进行试验。使用Dounce匀浆器将刷状边缘膜粉碎。
离心条件
其他工人使用的离心次数和g力通常更严重:4h为170,000 g或18h为200,000 g。
梯度分析
经常检查在梯度中的筏和非筏标记的分布，以确认离心已经取得了令人满意的筏的分辨率和回收率。一旦确认梯度中标记条带的模式是可重复的，那么就有可能使用注射器和金属套管或自动移液管回收筏和其他部分。
技术总论
Macdonald和Pike报道70%的EGFR和40-50%的RAS和flotillin在梯度顶部的主要RAFT（可逆加成-断裂链转移聚合）组分中被发现。小囊蛋白的分布与Smart等人在第一个连续的碘克沙醇梯度中发现的分布没有不同，即它存在于低密度的RAFT组分中，但大多数在也含有内质网标志蛋白Calnexin的较密度组分中被检测到。由于梯度是连续的，而不是像含有洗涤剂的策略那样是不连续的，因此标记分布显示出相当大的复杂性并不出人意料。例如，已建立的RAFT标记蛋白flotillin（筏蛋白）并不局限于最上面的三个部分，而是延伸到像胆固醇一样的更高密度，尽管它们都重叠于非RAFT标记(如转铁蛋白受体)，但它们的分布表明，梯度可能能够部分溶解密度稍高的RAFT部分。
研究鞘糖脂、含α-亚麻酸GM1a (C18:3-GM1a)、含硬脂酸GM1a (C18:0-GM1a)和溶鞘糖脂对神经母细胞瘤细胞中神经细胞黏附分子(NCAM)分布的影响，比较含洗涤剂的蔗糖梯度和不含洗涤剂的碘克沙醇梯度。在两个梯度中，lyso-GM1a完全去除了低密度的NCAM，而C18:3-GM1只在无洗涤剂的碘克沙醇梯度中使NCAM变为高密度。虽然这些观察结果强调需要在各种富脂域分离策略之间进行更多的比较研究，但有一些明确的迹象表明，去污剂方法和非去污剂方法可以提供类似的数据。Inoue等研究了刷状边缘膜中的ⅡA型钠/磷酸盐共转运蛋白(NaPi)，并报道了膜的简单洗涤剂提取和不含洗涤剂的碘克沙醇梯度均表明该蛋白具有筏形位置。
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