【Serumwerk】内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离——光滑内质网与其他细胞器和脂滴之间的通信研究

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

线粒体相关膜(MAM)分离

Lewin等人制备标准大鼠肝匀浆，并将核后上清液(PNS)加载到20-40%碘克沙醇梯度上。们研究的主要目的是确定酰基CoA合成酶4的定位。对梯度部分进行了广泛的标记分析，包括:酰基辅酶a合成酶1(位于ER);用酰基辅酶a合成酶5、谷氨酸脱氢酶和甘油-3-磷酸酰基转移酶对线粒体进行鉴定。采用磷脂酰乙醇胺甲基转移酶鉴定MAM。该梯度能够分解过氧化物酶体、线粒体、MAM和内质网。

在Myhill的研究中，HeLa细胞使用滚珠匀浆机在常规HEPES缓冲0.25 M蔗糖溶液含1 mM EDTA中匀浆。将PNS加载到约5 ~ 25% (w/v)的碘克沙醇梯度(由间隔5%的阶梯梯度扩散产生)上。12万g处理3 h。两种模式之间一个非常明显的区别是MAM与ER和线粒体的相对显带位置。在大鼠肝脏中，MAM与线粒体分离良好，但与内质网重叠;在HeLa细胞中，MAM与内质网分离良好，但与线粒体结合。目前尚不清楚这是两种来源之间的区别，还是碘克沙醇梯度密度范围的差异，或者两者都有。Lewin等使用的20-40% (w/v)碘克沙醇梯度范围为1.127 ~ 1.223 g/ml, Myhill等使用的碘克沙醇梯度范围为1.054 ~ 1.151 g/ml。后一个梯度也被用于研究(a)在HEK细胞中内质网氧化还原蛋白(Ero1)定位到MAM，发现这依赖于内质网中的氧化条件;(b)在HeLa细胞中Rab32调节MAM的性质，特别是Ca2+和钙连接蛋白的富集。类似于Myhill等和Gilady等使用的10-30% (w/v)碘克沙醇的不连续梯度也分解了高尔基体，ER和MAM，并揭示了跨膜硫氧还蛋白家族蛋白(TMX)和calnexin的棕榈酰化影响了它们在MAM中的富集。此外，calnexin的棕榈酰化影响其功能特性。

l 碘克沙醇梯度也被用于明确的SER分辨，主要来自溶酶体，但也来自其他细胞器，如过氧化物酶体和线粒体，在初始蔗糖梯度分离之后。Radhakrishnan等针对CHO-K1细胞开发的方法已扩展到HEK细胞、尼曼- pick C型细胞、HepG2细胞、HeLa细胞和小鼠肝脏。

内质网-高尔基体转运(包含COPII的囊泡)（EndoR-Golgi transport (vesicles containing COPII)）分离

碘克沙醇梯度能够从内质网中分离出出芽的供体膜囊泡:Gorur等人通过7000 g沉淀法去除完整的内质网膜，随后通过从上清液(调整为22%碘克沙醇)层通过上18%碘克沙醇层(250,000 g作用90分钟)浮选使囊泡浓缩。总的梯度体积为0.25 ml。在更大的尺度上，Ding等将3 ml的核后上清液在9 ml 5-30%碘克沙醇梯度上分层(20万g作用4小时)，将含有钙连接蛋白的致密ER与轻得多的COPII囊泡分离。

脂滴（lipid droplet）

采用氮空化法将人肝癌细胞匀浆，并将PNS调整为30% (w/v)碘克沙醇。将其覆盖在20%和10%碘克沙醇层上，分别以190,000 g或220,000g离心3 h。脂滴集中在梯度的顶部。Suzuki对HeLa细胞和Akil对Huh7细胞采用相同的三层浮选梯度;然而，离心条件相当不同:166,000 g 5小时和200000 g 16小时。Buers在巨噬细胞的研究中使用了类似的浮选方法，但梯度跨度较大，包括40%、30%和20% (w/v)的碘克沙醇，但g-力要小得多，只有1小时。在所有情况下，脂滴均从梯度的顶部回收。另外使用碘克沙醇梯度，可以研究人乳腺癌细胞，骨骼肌组织和小鼠肝细胞的脂滴。

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