【Serumwerk】从Caco-2细胞的顶端和基底外侧质膜结构域的分离
从Caco-2细胞的顶端和基底外侧质膜结构域的分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
C. 均质缓冲液：3 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4
D. OptiPrep™稀释缓冲液：18 mM EDTA, 60 mM Tris-HCl, pH 7.4
E. 工作液(50% w/v碘克沙醇)：5体积Optiprep™与1体积溶液D混合
F. 钙离子溶液：100mm CaCl2
试验方法
请在0 ~ 4℃进行除步骤1外的所有操作。
1．根据需要在渗透性支架上培养Caco-2细胞。
2．用淀帚把滤器上的细胞刮到冰冷的PBS中。
3．将细胞在600 g下颗粒化10 min(或在离心器中20秒)并用PBS洗涤细胞一次。
4．将细胞悬浮于5 ml溶液C中，并在紧密Dounce(玻璃)或Potter-Elvehjem(特氟龙玻璃)匀浆器中进行匀浆。
5．将匀浆1000 g离心5 min，使未破碎的细胞、细胞核和碎片成球。
6．仔细抽吸上清液并以10,000 g离心，使线粒体、大部分溶酶体和过氧化物酶体成球。
7．仔细抽吸上清液；加入1/10体积的F溶液并在冰上放置30分钟。
8．在冰上孵育期间，用溶液C将溶液E稀释成体积比分别为4:1、3:2和1:9的溶液，制备40%、30%和5% (w/v)碘克沙醇溶液。
9．以10,000 g将悬浮液(步骤7)离心15 min。
10．抽吸并保留上清液，将含有基底外侧PM结构域的颗粒重新悬浮于1-2 ml 40%碘克沙醇中。
11．从上清液中以100,000 g将顶端PM结构域颗粒化30 min。
12．在离心过程中，用双腔梯度发生器或Gradient Master™在摇摆桶转子管中从等体积的30%和5% (w/v)碘克沙醇溶液中制备11-12 ml连续梯度。
13．使用注射器和金属套管，使用步骤10中的基底外侧PM域悬浮液垫压梯度。
14．将梯度165,000 g离心 3小时，允许转子减速，没有刹车低于2000转或使用控制减速程序。
15．通过上移、穿刺或抽吸半月板去除梯度0.5 ~ 1.0 ml。
方法注释
均质介质和梯度溶液
通常必须将均质化培养基裁剪成组织或细胞类型并且不知道HM的组合物是否与本申请单中所述的分离相关。介绍了有机渗透平衡剂如蔗糖、甘露醇和山梨醇在亚细胞膜功能研究中的相容性;此外，这些低离子强度的HMs和梯度溶液允许直接使用馏分进行SDS- PAGE。最常用的等渗HMs含有0.25 M蔗糖缓冲液与Tris, Hepes, Tricine或三乙醇胺(10-20 mM浓度)，通常(但不总是)含有1 mM EDTA。用无机盐补充HM变得越来越常见，可以减少离子相互作用，膜之间的聚集，并对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。一些不含蔗糖的培养基完全使用氯化钠或氯化钾或两者作为主要的渗透平衡剂。在本方案中，通常使用低渗培养基使细胞膨胀，从而促进均质化。这对质膜域分离可能是重要的，但也可能引起一些细胞器，如线粒体和溶酶体的碎片。只有实验才能确定Caco-2细胞或其他极化细胞是否允许使用其他均质化培养基。通过首先制备含3 mM EDTA, 10 mM Tris- hcl, pH 7.4的50% (w/v)碘克沙醇工作液(溶液E)的策略，EDTA和Tris的浓度将在整个梯度保持恒定。如果利用溶液C简单地通过OptiPrep™稀释来制备梯度溶液，则不会出现这种情况。
●可根据操作者的判断将蛋白酶抑制剂添加到溶液C和D中。
均质化
虽然Musch等人在Potter-Elvehjem均质器的舂杵上使用了20下，但这可能不是唯一有效的均质化方案。此外，该方法可能需要定制为其他极化细胞。Dounce和Potter-Elvehjem均质化曾经是最广泛使用的程序，但滚珠轴承均质器(“细胞裂解器”)现在被认为是最有效和可重复的设备之一。如果这是不可用的，然而通过注射器针头的10-20通道(标尺编号(G)从21到25不等)通常是一个有效的替代方案。偶尔使用注射器针头前会先进行Dounce匀浆。理想情况下，操作应尽可能温和和可重复，目的是造成至少95%的细胞破坏，而不破坏主要细胞器，特别是细胞核和溶酶体。均质化过程的类型和严重程度将对细胞器的完整性和细胞质中由管状结构产生的囊泡的大小产生影响。因此，膜带在任何后续梯度中的模式可能不容易预测。
差速离心
Musch等人省略了这一步并将匀浆直接离心至10,000g。特别是细胞核在这些条件下将非常迅速地沉积，这可能导致较小颗粒的捕获和损失。
密度梯度
如果这两种梯度制造装置都不具备，那么可以通过不连续梯度的扩散来制备连续梯度(使用等体积的5%、10%、15%、20%、25%和30% (w/v)碘克沙醇)。
梯度分析
10-15% (w/v)碘克沙醇区域的基底外侧膜带，其密度略高于报道的其他质膜分离梯度(5-10%碘克沙醇)，但它可能反映了CaCl2的结合，这是这种分离类型特有的。
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