【Serumwerk】心肌质膜（Myocardial plasma membrane）的分离
心肌质膜的分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 均质培养基(HM): 0.1 M蔗糖，10 mM EDTA, 46 mM KCl, 5 mM NaN3, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4
C. OptiPrep™稀释剂:0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 60 mM Tris-HCl, pH 7.4
D. 50% (w/v)碘克沙醇(ρ = 1.272 g/ml)工作溶液(WS): 5体积溶液A + 1体积溶液C
E. WS稀释剂:0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。
1．将5 g冰冻组织置于生理盐水中，剥去心外膜和心内膜。
2．将组织置于溶液B (0.2 g/ml)中并切碎以产生2 mm3碎片。
3．使用宽松的Dounce均质器(惠顿B型)的杵的30个循环使组织均质，然后在紧合的Dounce均质器(惠顿a型)中使用相同数量的次数。
4．将匀浆以4000 g离心10 min并收集上清液。
5．通过混合9体积和1体积溶液D将4000 g上清液调整为5% (w/v)碘克沙醇。
6．将溶液D和E分别混合1.5体积和3.5体积，配制15% (w/v)碘克沙醇溶液。
7．将10 ml 4000 g上清液转入5%碘克沙醇的转筒管中;使用注射器和金属套管将1.5 ml的15%碘克沙醇覆盖在底部，然后覆盖约1 ml溶液E。
8．在80000 g离心16小时。
9．通过导管穿刺、半月板抽吸或向上移位等方法，从梯度上方收集质膜组分或梯度组分0.5 ml。
方法注释
匀浆低速离心
常规的在500-4000 g下进行5-10 min的核造粒;更高的RCFs (g力)导致一些线粒体的去除。为了回收被困在颗粒中的任何囊泡(在RCFs较高的情况下更严重)，有时将颗粒重新悬浮在HM中，离心，并将两种上清液结合在一起。这种做法的一个可能的缺点是，除非颗粒的重悬非常温和，否则细胞核可能被破坏，从而导致DNA的泄漏，这可能导致亚细胞膜几乎不可逆的聚集。
分析
在离心后的梯度中观察到5个可见的层，质膜(Na+ -K+ -ATP酶)被限制在最低密度，而ER，由SERCA2 Ca2+泵确定，在两个最密集的部分中，只有一个(较轻的一个)也包含葡萄糖转运蛋白GLUT4。应用该方法研究了心力衰竭葡萄糖氧化升高时GLUT4向质膜的转位，高同型半胱氨酸血症心肌一氧化氮的调节;一氧化氮抑制心肌葡萄糖转运水通道蛋白表达及研究SUR亚基在KATP通道膜靶向调节中的作用。
其他方法的修改
Hong等人将g和时间离心时间增加到20000g，离心2.5小时，观察到7个不同的材料区域。随后的改进包括将下层碘克沙醇的密度增加到18% (w/v)，并将离心时间减少到1 h。
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