【Serumwerk】Polymorphprep™产品使用说明

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Serumwerk Bernburg AG

Serumwerk Bernburg AG 1895 Polymorphprep™

产品信息

1. 组成

泛影葡胺钠 13.8 % (w/v) ，多糖8.0 % (w/v)

2. 理化特性

密度：1.113 ± 0.001g/ml

渗透压：445 ± 15 mOsm

内毒素水平：< 1.0 IU/ml

3. 稳定性和存储

保持无菌和防止光照条件下，Polymorphprep™可稳定保存3年。

产品介绍

Polymorphprep™ 高渗透压导致红细胞失水和收缩，从而增加其有效浮力密度。这使得右旋糖酐聚集的红细胞能够通过致密的培养基快速沉淀。由于培养基和红细胞之间的渗透梯度随着细胞进一步沉降到培养基中而下降（即红细胞的水分损失在多态体的顶部最大，并随着它们进一步沉降而逐渐减少）在密度屏障内形成了一个斜位梯度。当单个核细胞保持在样品/介质界面时，PMNs带在该密度梯度内。该方法仅对未稀释的全人血液有效，对富白细胞部分或动物血液无效。

温度对获得最佳结果很重要，因为温度的变化会影响多晶溶液的密度和粘度。血样和培养基的温度应保持在18 - 22°C之间。

Polymorphprep™之上的细胞带只包含外周血单个核细胞（PBMCs）。细胞带本身可以被分离成淋巴细胞和单核细胞。所有的PMN都在底部的细胞带中，即Polymorphprep™ 的封闭带。红细胞对PMN带的污染占细胞总数的2 - 6%.

分离程序

1. 准备血液样本

为了获得最佳效果，使用经EDTA、肝素或柠檬酸盐等抗凝剂处理过的全血。我们推荐EDTA (钾盐)以获得最佳效果。从献血者身上抽血后应在两小时内用完。血液样本和Polymorphprep™ 溶液应在18-22°C的温度下，并在离心期间保持在这些限制范围内。

2. 梯度的准备

小心地将5.0 ml抗凝全血分层在5.0 ml Polymorphprep™上，放入15ml离心管中，或将18 ml血液分层在18ml Polymorphprep™上，放入50ml离心管中。注意避免血液与分离液混合。始终使用等量的血液和PolymorphprepTM，并选择一根保持与推荐的5ml + 5ml管相似的层几何形状的管。

3. 分离过程

在18-22°C的摆动转子中，在500-550 gav下离心30分钟。允许转子减速而不中断。离心时间较长或离心力较大将导致PMN进一步向球粒红细胞迁移。

4. 卸载梯度

离心后，两条白细胞带可见。样品/介质界面的上带由单个核细胞组成，下带由PMNs组成;红细胞呈颗粒状。细胞带最好使用2毫升注射器连接到扁平的金属填充套管(内径0.8毫米)。PMN应加入1体积0.45% NaCl溶液或0.5正常浓度的培养基稀释，以恢复正常渗透压。进一步稀释使用生理盐水或培养基。

5. 清洗

将悬浮液转移到15ml的试管中，细胞在大约。400 g浸泡10分钟(18-22°C)。它们在盐水或培养基中重悬，再次沉淀，然后在与后续分析相容的培养基中重悬。

6. 回收率和/或纯度

污染的红细胞可在0.83%（w/v）氯化铵，10 mM HEPES-NaOH，pH 7.4中在室温下孵育3 min，然后用生理盐水稀释，离心收集嗜中性粒细胞。