【Serumwerk】膜运输及传导分析：培养的细胞（Cultured cells）分析——浮力密度梯度

A. OptiPrep™

B. Optiprep™稀释剂:235 mM KCl, 12 mM MgCl₂, 25 mM CaCl₂，30 mM EGTA, 150 mM Hepes NaOH pH 7.0

C. 40%碘克沙醇工作溶液(WS): 2体积溶液A + 1体积溶液B

D. WS稀释液:78 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 8.4 mM CaCl₂，10 mM EGTA, 50 mM Hepes-NaOH pH 7.0

E. 均质培养基:0.25 M蔗糖，78 mM KCl, 4 mM MgCl₂，8.4 mM CaCl₂, 10 mM EGTA, 50 mM Hepes-NaOH pH 7.0 

遵循任何允许配体结合、摄取和处理或其他功能性操作的实验程序，所有操作必须在4℃下进行。

1．用与本研究相容的任何溶液洗涤细胞单层两次，去除细胞表面的任何未结合的配体或其他成分，然后将细胞刮入1 ml溶液E中。

2．使用滚珠轴承均质器(细胞裂解器)使细胞均质化;细胞悬液四次就足够了。用相差显微镜检查是否有充分的均质化。如果没有这样的装置，则使用细针注射器或Dounce匀浆器。

3．将匀浆在摆动桶转子中1000g离心5分钟，使细胞核和任何细胞碎片成球。如有必要，可用溶液E洗涤颗粒，并将两种上清液组合。

4．用溶液D稀释溶液C，制备5%和20% (w/v)碘克沙醇低密度梯度溶液和高密度梯度溶液。

5．在用于摇摆桶转子的管中，使用双腔梯度发生器或梯度Master制备12-13 ml 5-20% (w/v)的碘克沙醇梯度。

6．将1000g上清液置于梯度上，90000 g离心18-20 h。

7．从半月板上通过密集液体向上移位、导管穿刺或抽吸的方式收集梯度，每次约0.25 ml。

8．如果需要去除碘克沙醇，可以用2体积的溶液E稀释后，在20万g下沉淀20分钟。

均质介质和梯度溶液

均质化培养基通常必须根据组织或细胞类型进行定制。介绍了有机渗透平衡剂如蔗糖、甘露醇和山梨醇在亚细胞膜功能研究中的相容性；此外，这些低离子强度的HMs和梯度溶液允许直接使用馏分进行SDS-PAGE。尽管0.25 M蔗糖与Tris, Hepes, Tricine或三乙醇胺(在10-20 mM浓度)缓冲，含有EDTA或EGTA仍然是组织和培养细胞的广泛使用的HM，特别是后者，补充无机盐，如本方案中，是越来越常见的，可以减少离子相互作用，膜之间的聚集，并对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。一些不含蔗糖的培养基完全使用氯化钠或氯化钾或两者作为主要的渗透平衡剂。HM的组成也应与任何后续分析过程兼容。二价阳离子的加入可以防止核破裂；一般稳定膜，但可能导致聚集。

使用Optiprep™稀释剂(溶液B)含有235 mM KCl, 12 mM MgCl₂，25 mM CaCl₂，30 mM EGTA, 150 mM Hepes-NaOH pH 7.0产生40% (w/v)碘克沙醇工作溶液，确保KCl, MgCl₂, CaCl₂，当该溶液被溶液D稀释时，EGTA和缓冲液在梯度中保持恒定。的确，梯度的渗透压浓度也将与HM(溶液E)中近似相同，碘克沙醇和蔗糖对溶液提供几乎相同的渗透压贡献。

PC12细胞，HeLa细胞，CHO细胞，COS-7细胞，HEK293细胞，肾上皮细胞，纤维肉瘤细胞系，极化的人气道上皮细胞和培养的单核细胞使用相同的匀浆培养基和梯度溶液。

如果必须使用低渗培养基使细胞膨胀以达到充分的均质化程度，则重要的是尽快将均质物恢复到等渗状态。

l l根据操作者的判断，蛋白酶抑制剂可包括在方案B、D和E中。

均质化

均质化方案应根据细胞(或组织)类型量身定制。Potter-Elevhjem组织匀浆和Dounce细胞匀浆曾经是标准程序。对于通过27或25号注射器针头传代5-15次的细胞，有时在此之前进行Dounce匀浆，这是比较常见的。滚珠轴承均质器(“细胞裂解器”)现在被广泛认为是最有效和可重复的设备之一。理想情况下，操作应尽可能温和和可重复，目的是造成至少95%的细胞破坏，而不破坏主要细胞器，特别是细胞核和溶酶体。均质化过程的类型和严重程度将对细胞器的完整性和细胞质中由管状结构产生的囊泡的大小产生影响。因此，膜带在任何后续梯度中的模式可能不容易预测。

梯度和离心条件

如果这两种梯度制造装置都不可用，则可以通过扩散不连续梯度来制备连续梯度。

上述方案中描述的长自旋5-20% (w/v)碘克沙醇梯度现已用于各种细胞类型，其g力和离心时间(90000 -125,000 g, 15-20h)的变化较小。细胞类型包括CHO、COS-7、HeLa、HepG2人气道上皮细胞和PC-12。

其他方案

Idkowiak-Baldys等人对HEK细胞使用了5%，10%，15%和20% (w/v)碘克沙醇的不连续梯度，而不是推荐的5-20%连续梯度，但由于梯度在相对低的g力下离心至少16小时，梯度将变得连续和或多或少的线性扩散。

Lin等人使用PC12细胞，通过滚珠轴承匀浆器进行单次传代渗透性，分离出含有囊泡的部分。这是第一个分离在0 - 30% (w / v) iodixanol沉降速度梯度和分数梯度iodixanol调整至32%,进一步分离浮选通过long-spin 0 - 30% iodixanol梯度在133000 g 18 h。Li等人使用2%，24%和32% (w/v)碘克沙醇(样品在后者)的不连续梯度，在83,000 g离心2小时分离(按照密度增加的顺序)来自MCF7细胞的质膜，早期/再循环内体，线粒体和过氧化物酶体。

分析检查

Sheff等人用经典的脉冲追踪技术研究了转染人转铁蛋白受体的MDCK细胞对125i -转铁蛋白的摄取。数据汇总于图1中。早期核内体(2.5 min)条带密度显著高于循环核内体(25 min)，两者的平衡密度均显著高于质膜或溶酶体。后者的位置通过β -己糖胺酶活性确定。虽然质膜的相对位置是可变的，但梯度结构通常能够将质膜从早期和晚期核内体中分离出来;它通常比核内体轻，但也可能在某些情况下密度更大。Sugii也证明了来自CHO细胞的TGN(比晚期核内体更密集)也有一个独特的带。在几乎所有情况下，早期核内体都被报道为比晚期核内体密度低，并且可能存在一些独特的再循环核内体带，尽管后者和早期核内体之间通常有显著的重叠。Sheff等报告了用于再循环内体的略低密度。

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