【Serumwerk】膜运输及传导分析：配体（Ligand）——自生成梯度

A. OptiPrep™

B. 稀释剂:0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 60 mM Tris-HCl, pH 7.4

C. 50%碘克沙醇(ρ = 1.272 g/ml)工作液:5体积溶液A + 1体积溶液B。

D. 均质培养基:0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4

根据需要使用所选择的组织或细胞系统进行任何配体结合、摄取和处理。随后必须在4℃下执行所有操作。

1．在溶液D中使组织(或细胞)均质化:对于哺乳动物肝，使用Potter-Elvehjem均质器的研棒(500 rpm)敲6-8下。使用约4 ml / g组织。

2．将匀浆在摇桶转子中以3000 gav离心10分钟。如果需要，可以用溶液D洗涤颗粒，并将两种上清液混合。

3．用溶液D将溶液C稀释成20%碘克沙醇溶液(ρ= 1.127 g/ml)。

4．用溶液C 3:1(终浓度= 12.5%碘克沙醇)稀释3000 g上清液。

5．将约9毫升的悬浮液转移到合适的管(10-12毫升)，用于垂直或接近垂直的转子;用1.5 ml 20%碘克沙醇垫底，用溶液D覆盖以填充管。

6．离心机在约350,000 gav 1.5小时(缓慢加速程序到800 rpm)。从800转/分开始使用缓慢减速程序(或无刹车)。

7．通过导管穿刺、用致密介质向上移位或从半月板抽吸约0.5 ml的方法收集梯度，并根据需要进行分析。

8．如果需要从组分中去除胞质蛋白和/或浓缩它们，用等体积的缓冲液稀释并在约35万g的浓度下沉淀膜15分钟。

均质介质和梯度溶液

通常必须将均质培养基裁剪成组织或细胞类型并且不知道HM的组成是否与分离相关。介绍了有机渗透平衡剂如蔗糖、甘露醇和山梨醇在亚细胞膜功能研究中的相容性;此外，这些低离子强度的HMs和梯度溶液允许直接使用馏分进行SDS-PAGE。尽管0.25 M蔗糖与Tris, Hepes, Tricine或三乙醇胺(在10-20 mM浓度)缓冲，含有1 mM EDTA仍然是组织和培养细胞的广泛使用的HM，特别是后者，补充无机盐是越来越常见的，可以减少离子相互作用，膜之间的聚集和对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。一些不含蔗糖的培养基完全使用氯化钠或氯化钾或两者作为主要的渗透平衡剂。HM的组成也应与任何后续分析过程兼容。二价阳离子的加入可以防止核破裂;一般稳定膜，但可能导致聚集。

如果需要低渗培养基使细胞膨胀以达到充分的均质化，则重要的是尽快将均质物恢复到等渗状态。可根据操作者的判断将蛋白酶抑制剂包括在溶液B和C中。

均质化

均质化方案应根据细胞(或组织)类型量身定制。Potter-Elevhjem组织匀浆和Dounce细胞匀浆曾经是标准程序。对于通过27或25号注射器针头传代5-15次的细胞，有时在此之前进行Dounce匀浆，这是比较常见的。滚珠轴承均质器(“细胞裂解器”)现在被广泛认为是最有效和可重复的设备之一。理想情况下，操作应尽可能温和和可重复，目的是造成至少95%的细胞破坏，而不破坏主要细胞器，特别是细胞核和溶酶体。均质化过程的类型和严重程度将对细胞器的完整性和细胞质中由管状结构产生的囊泡的大小产生影响。因此，膜带在任何后续梯度中的模式可能不容易预测。

胞质蛋白

通过去除分离后的胞质蛋白，核内体不需要在分离前被造粒和重悬。小体积开顶厚壁管微离心分离机是一种回收膜沉降物的方便方法。350,000 g时使用时间不要超过15分钟，100,000 g时使用时间不要超过1-1.5小时，否则碘克沙醇分子本身的沉降可能会干扰成球。

梯度分析

在推荐的条件下，梯度包含一个中央浅区域，将轻和致密的核内体分开。溶酶体带在管的底部形成陡峭的梯度，而线粒体和过氧化物酶体带在溶酶体下方。溶酶体和最致密的内体之间的质膜带(未显示)。为了获得更线性的梯度，需要更长的离心时间。有效自产生碘克沙醇梯度所需的最小重力力为180,000 gav，但在这种低重力力下难以实现线性梯度。为了将倾向于高密度的早期网格蛋白包被囊泡和质膜分离，碘克沙醇的起始浓度应提高至15%或17.5% (w/v)。在这一区域已被鉴定的质膜也含有网格蛋白并解释其相对较高的密度。为了更有效地分析低密度核内体，可将碘克沙醇起始浓度降低至10% (w/v)。

Molinari等人在幽门螺杆菌空泡毒素诱导HBK细胞空泡化的研究中分离了晚期内体、空泡和溶酶体。CI-M6PR是一个晚期核内体和反高尔基体网络标记，显示后者条带的密度(峰分数4)略低于溶酶体。该分离在贝克曼NVT90近垂直旋翼中实施。

其他自生成的梯度

由三层而不是两层组成的梯度也有报道:1.2 ml 10%， 1.3 ml 20%和2.4 ml 30% (w/v)碘克沙醇，后者含有来自CHO细胞的3000 g - 10分钟上清，在Beckman NVT90近垂直转子中以35万g离心3小时，创建非常接近线性的梯度。梯度用于分析早期和循环内体。在核内体转运进展的研究中，一个更标准的策略是用均匀密度的溶液(30%碘克沙醇)在365,000 g离心4 h，从核内体中分离ER和TGN。

Landry等人使用了类似于Chen等人描述的梯度系统;将2.5 ml HeLa细胞核后上清液(PNS)调整为30%碘克沙醇(总量2.5 ml);层状下约1.2 ml 20%和10%碘克沙醇，在36万g下离心3小时。该系统被用于证明细胞死亡信号与循环内体运输到高尔基体的转移相关。在一个更简单的梯度系统中，将来自脑细胞群的PNS简单地调整为13%碘克沙醇;在去甲肾上腺素转运蛋白运输的研究中，自行生成的碘克沙醇梯度被用于分离早期和晚期内体。自身产生的梯度也被用于研究鼠疫耶尔森菌感染时巨噬细胞对毒力抗原的摄取。

Lampugnani等人使用了Yeaman等人首先描述的策略，使用等体积的10%，20%和30% (w/v)碘克沙醇，在Beckman Vti65.1垂直转子的管中，以350,000 g离心3小时，创建一个几乎线性梯度。梯度分析了内皮细胞对血管内皮钙黏蛋白的内化，并能够为质膜、网格蛋白包被的囊泡和早期内体提供独特的带型。

3T3-L1脂肪细胞的低密度膜组分，调整为14% (w/v)碘克沙醇，在Beckman TLN100旋盘中，在295,000 g浓度下自我生成，梯度分离1小时。该梯度能够分解组成型再循环池(核内体再循环室)和胰岛素敏感的GLUT4储存囊泡。

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