【Serumwerk】肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages）的分离
所需溶液制备
A. OptiPrep™（使用前轻轻摇瓶）
B. 灌洗介质：磷酸盐缓冲盐水（PBS）
C. 细胞悬浮介质：Ca2+/Mg2+游离Hank’s平衡盐溶液
试验方案
1. 用溶液C稀释OptiPrep™，配制5% (w/v)和30% (w/v)碘克沙醇溶液，体积比分别为5 + 55和1 + 1。
2. 用溶液B灌洗肺
3.通过一个22 μm孔径的尼龙膜过滤器。
4. 500 g离心15 min收集细胞，在溶液C中重悬
5. 在离心过程中，使用双腔梯度标记器或Gradient Master™在15mL管中从5mL 5%和5mL 30%碘克沙醇溶液产生线性梯度。
6. 将细胞悬液置于顶部并以800 g离心20 min。
7. 收集约15%碘克沙醇下条带的巨噬细胞。
方法注释
1. 可以使用任何合适的等渗培养基或平衡盐溶液。
2. 组织分解所需的时间可能需要根据所使用的动物种类进行修改。
3. 在使用弹性蛋白酶而不是胶原酶之前，还可以使用其他更复杂的肺灌洗组织分解技术。
4. OptiPrep™与稀释液的比例取决于是否包括胎牛血清（FBS）；胎牛血清稀释剂密度约为1.009 g/ml，没有胎牛血清密度约为1.006 g/ml。
5. 如果Gradient Master™不可用，那么可以使用双室梯度制造器，但以避免细胞悬浮液的剧烈搅拌。它可能更适合从溶液A和溶液D中提取1.04 g/ml的溶液（即无细胞溶液），然后将粗细胞悬液（溶液D）层放在上面。另外，不连续梯度可以通过2.5毫升的扩散产生，分别使用1.040 g/ml（含细胞）、1.075g/ml、1.110 g/ml和1.145 g/ml（相当于约6%、13%、20%和27%（w/v）碘二醇）。
6. 内皮细胞+巨噬细胞构成密度最低的带（约1.049 g/ml），上皮细胞带在1.059-1.062 g/ml，成纤维细胞和红细胞构成1.069-1.096 g/ml，最密集的带（1.113 g/ml）包含成纤维细胞+非活细胞+细胞碎片。
7. 或者，连续梯度可以通过不连续梯度扩散产生，分别使用2.5mL的5%、10%、15%、20%和30%（w/v）碘二醇。
肺泡II型细胞（Alveolar Type II cells）的分离
一种简单的两层梯度，密度分别为1.040和1.080 g/ml的碘二醇，用于从人肺组织中部分纯化II型肺泡细胞，然后用磁珠阴性选择进一步纯化。由于碘二醇是一种密度为1.32 g/ml的无菌溶液（OptiPrep™），因此大大简化了梯度溶液的制备。如果使用普通平衡盐或缓冲盐水溶液稀释OptiPrep™，则这两种密度约为6.5%和14%（w/v）碘二醇，即OptiPrep™：稀释剂比例为6.5：53.5和14：46。
单核/淋巴样/造血型细胞（Mononuclear/lymphoid/haematopoietic type cells）的分离
髓系和淋巴细胞的分离也采用了4%和14.5%（w/v）的两层碘二醇梯度，600 g离心20 min。这种梯度也被用于分离造血细胞。从肺组织中提取的白细胞（单核细胞）已在由OptiPrep™（用含有10% FCS的RPMI稀释）制备的1.079 g/ml屏障上分离。
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