【Serumwerk】膜运输及传导分析：配体（Ligand）分析——沉降速度梯度
配体分析不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
均质培养基(HM)：0.25 M蔗糖，1 mM EGTA, 10 mM Hepes- NaOH, pH 7.2
碘二醇原液：将4.5体积与1.5体积OptiPrep™稀释剂混合。根据需要将蛋白酶抑制剂添加到任何溶液中。
试验方法
允许肝细胞悬液在适宜的孵育缓冲液中于4℃结合125i标记的去唾液酸胎儿球蛋白(asialofetuin) 60 min。然后在随后37℃孵育期间将配体内化，时间分别为30秒、60秒、2.5分钟、15分钟或30分钟。在每个时间段结束时，通过添加含有EGTA的冰冷孵育缓冲液来停止内化。在4℃下执行以下所有步骤。
1．在HM溶液中洗涤细胞，去除任何表面结合的配体，然后在该溶液中使用Dounce匀浆器的杵敲20下使其均质化。
2．在2000 gav下离心5分钟，将碎片和细胞核制成颗粒;然后滗出并保留上清液。
3．在HM中重新悬浮颗粒；以2000 g重新离心并合并两种上清液。
4．使用标准的双腔梯度发生器或Gradient Master™从等体积的原液和HM中制备34 ml连续的0-45% (w/v)碘克沙醇梯度，在36-40 ml管中用于合适的摆动桶转子。
5．在每个梯度上装载约4 ml的每份样品。
6．在4℃下以85,000 gav离心梯度45分钟；允许转子在没有刹车的情况下从2000转减速。
7．通过向上位移卸载2ml的梯度，并分析部分。
方法注释
均质介质和梯度溶液
通常必须将均质培养基裁剪成组织或细胞类型并且不知道HM的组成是否与分离相关。介绍了有机渗透平衡剂如蔗糖、甘露醇和山梨醇在亚细胞膜功能研究中的相容性;此外，这些低离子强度的HMs和梯度溶液允许直接使用馏分进行SDS-PAGE。尽管0.25 M蔗糖与Tris, Hepes, Tricine或三乙醇胺(10-20 mM浓度)缓冲仍然是一种广泛使用的HM，补充无机盐变得越来越常见，可以减少离子相互作用，膜之间的聚集，并对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。一些不含蔗糖的培养基完全使用氯化钠或氯化钾或两者作为主要的渗透平衡剂。HM的组成也应与任何后续分析过程兼容。二价阳离子的加入可以防止核破裂;一般稳定膜，但可能导致聚集。如果使用低渗培养基使细胞膨胀以达到充分的均质化程度，重要的是尽快将均质物恢复到等渗状态。OptiPrep™稀释剂的使用通过梯度保持EGTA和缓冲液的浓度恒定。如果认为这不是关键，则可使用HM稀释OptiPrep™。
均质化
均质化方案应根据细胞(或组织)类型量身定制。Potter-Elvehjem组织匀浆和Dounce细胞匀浆曾经是标准程序。对于通过27或25号注射器针头传代5-15次的细胞，有时在此之前进行Dounce匀浆，这是比较常见的。滚珠轴承均质器(“细胞裂解器”)现在被广泛认为是最有效和可重复的设备之一。理想情况下，操作应尽可能温和和可重复，目的是造成至少95%的细胞破坏，而不破坏主要细胞器，特别是细胞核和溶酶体。均质化过程的类型和严重程度将对细胞器的完整性和细胞质中由管状结构产生的囊泡的大小产生影响。因此，膜带在任何后续梯度中的模式可能不容易预测。
梯度构建
如果两室梯度发生器和Gradient Master™均不可用于制备连续梯度，则这些可由不连续梯度的扩散形成。在这种情况下，层的体积为0%、10%、20%、30%和40% (w/v)碘克沙醇。如果有必要，调整所有体积比例，并确保加载样品后，管是正确填充。
分析
当配体从细胞表面被吸收后，它被包含在缓慢沉积的小颗粒中，随着时间的推移，这些颗粒的大小增加。15分钟后，颗粒增加到足够的大小，使其在45分钟的离心中达到浮力密度。在推荐的离心条件下，只有最大的核内体达到其浮力密度。当离心时间增加到3 h时，在早期的时间点，放射性标记的峰值也接近1.11 g/ml。在45分钟离心后以这种密度条带的颗粒可能是配体从溶酶体前区室排出，并在2.5 ~ 30分钟内降解。
推荐使用连接到配体的酪胺-纤维二糖来研究降解步骤。酪胺-纤维素二糖促进降解产物在细胞内的保留。通过比较酸溶性和酸可沉淀放射性标记，可以研究从溶酶体前体到初级溶酶体再到次级溶酶体的降解过程。
联合沉降速度和浮力密度分析
一项神经生长因子介导的信号转导研究调查了TrkA受体酪氨酸激酶和相关蛋白(APPL1和GIPC1)的作用，涉及一个特殊的胞内体群体。PC12细胞的核后部分首先在0-30% (w/v)碘克沙醇梯度上分层，并在133,000 g离心90分钟。梯度被收集成5个连续的部分，为了便于后续处理，将其调整为至少32.5% (w/v)碘克沙醇浓度，并与连续的0-30% (w/v)碘克沙醇梯度覆盖(或该部分可以在之前形成的梯度上覆盖)，并离心17小时。从第一个梯度的第二部分分离出两个完全不同的膜囊泡种群:较轻的种群(约1.12 g/ml)主要含有pTrk和少量的APPL1和GIPC1;密度较大的种群(约1.20 g/ml)几乎只含有APPL1。该方法后来应用于人神经母细胞瘤细胞。McCaffrey对方法和分析程序的详细描述表明，Rab5、Rab4和Rab7，分别是初级内吞囊泡、再循环内体和多囊泡载体囊泡的标记物，在梯度上呈现出独特的分布。
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