【Serumwerk】内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离——沉降速度梯度分离内质网、高尔基体和其他细胞器
内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
方案一
A. OptiPrep™
B. 均质培养基:0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM Hepes-NaOH, pH 7.4
C. 稀释剂:0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 60 mM Hepes-NaOH, pH 7.4
D. 50% (w/v)碘克沙醇(ρ= 1.272 g/ml)工作液:5体积溶液A+1体积溶液C
方案二
A. OptiPrep™
B. 均质介质:130 mM KCl, 25 mM NaCl, 1 mM EGTA, 25 mM Tris-Cl, pH 7.4
C. 稀释剂:130 mM KCl, 25 mM NaCl, 6 mM EGTA, 25 mM Tris-Cl, pH 7.4
D. 50%碘克沙醇工作溶液：溶液A的5体积+溶液C的1体积。
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。
1．使用溶液B(方案一或二)从所选组织或细胞产生匀浆。
2．以1000 g将匀浆离心10 min。
3．将上清液以3,000 g离心10 min，并保存上清液用于随后的梯度分离。
4．对于不连续梯度:通过混合适当体积的溶液B和D(方案一或二)，分别准备2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%和30% (w/v)碘克沙醇溶液各10 ml。对于连续梯度:准备20 ml 2.5%和30%溶液。
5．在13 ml的管为摆动桶转子(不连续梯度):每层1.2 ml的9梯度溶液;(连续梯度):使用双腔梯度发生器或Gradient Master™制作，用等体积的10%和30%碘克沙醇溶液配制12 ml梯度溶液。
6．将囊泡悬浮液分层置于梯度上方，以55,000 g离心90 min或以126,000 g离心25 min。
7．通过导管穿刺、半月板抽吸或向上移位等方法收集梯度0.5次。
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