【Serumwerk】内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离——连续梯度（16-18 h旋转）
内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 均质培养基:0.25 M蔗糖，140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0
C. 稀释剂:0.25 M蔗糖，140 mM NaCl, 3 mM EDTA, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0
D. 40% (w/v)碘克沙醇工作液(ρ = 1.224 g/ml):4体积溶液A+2体积溶液C
试验方法
该方案描述了培养的单层细胞。步骤1可在室温下实施，在4℃下实施所有后续步骤。
1．用磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞2次，用溶液B洗涤1次(不含EDTA)。
2．将细胞单层刮入溶液B中并使用不超过20次的Dounce匀浆器杵使细胞均质化。
3．在700-800 g下离心5 min，将碎片和细胞核颗粒化
4．减压并保留核后上清液(PNS)。
5．用溶液B将溶液D稀释，制备10%和40% (w/v)碘克沙醇梯度溶液。
6．使用标准的双腔梯度发生器或Gradient Master™，从等体积的两种碘克沙醇溶液中制备10-12 ml连续的10-40% (w/v)碘克沙醇梯度，用合适的摆动桶转子管。
7．在每个梯度上加载PNS (1-3 ml)。
8．将梯度在48000 g下离心18 h。
9．通过向上移位、从半月板抽吸或通过导管穿刺将梯度剥离约0.5 ml，并分析部分以寻找合适的膜标记。
方法注释
1. 虽然传统上使用含有EDTA的蔗糖缓冲等渗溶液作为细胞器分离的HM，但有一种趋势是使用更多的离子介质，包括NaCl或KCl(或两者)，特别是对于培养的细胞。用于制备密度溶液的溶液可含有替代缓冲液，如Tris、Tricine或三乙醇胺。
2. 可根据操作者的判断将蛋白酶抑制剂包括在溶液B和C中。
3. 稀释剂(溶液C)，用于制备40%碘克沙醇工作溶液(溶液D)，确保EDTA和缓冲液的浓度在整个梯度保持恒定。如果认为NaCl在整个梯度过程中是恒定的，那么溶液C中的NaCl应该是给定浓度的3x。然而，在这些条件下，梯度溶液将是高渗的。
4. 该方法应适用于较大或较小容积的转斗转子；增加或减少样品的体积，并按比例梯度。
5. 同质化方案需要根据细胞类型进行调整。Dounce均质化或通过25号注射器针头或有时两者的组合是常见的。滚珠轴承均质器(“细胞裂解器”)现在被广泛认为是最有效和可重复的设备之一。
6. 如果这两种梯度制造装置都不可用，则可以通过扩散不连续梯度来制备连续梯度。
7. 另一种方法是由多层制备的不连续梯度，层之间的密度增量非常小。这种梯度基本上可以看作是连续的和线性的。Lee等人提供了一个例子，使用5.0、6.5、8.5、10.5、12.5、14.5、16.5、18.5和20% (w/v)碘克沙醇各1 ml。
8. 有证据表明，粒子浮选比沉降能提供更好的分辨率。使用这种方法时，应将梯度调整为10-35% (w/v)碘克沙醇，囊泡悬浮液调整为40% (w/v)碘克沙醇，然后使用注射器和金属套管(i.d 0.9 mm)在梯度下分层。
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