【Serumwerk】从酵母球质体中分离液泡、前液泡、液泡下囊泡、分泌囊泡和Cvt囊泡的分离
从酵母球质体中分离液泡、前液泡、液泡下囊泡、分泌囊泡和Cvt囊泡的分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 洗涤缓冲液:10mm DTT, 10mm Tris-SO4, pH 9.4
C. 球质体缓冲液:1 M山梨醇，20 mM Pipes-KOH, pH 6.8。
D. 球体溶解培养基:200 mM山梨醇，20 mM Pipes-KOH, pH 6.8
E. 多聚蔗糖溶液:4%，10%和12% (w/v)多聚蔗糖溶液D。
F. 发泡介质:20 mM Pipes-KOH, pH 6.8
试验方法
球体隔离
1. 在OD600为0.8-1.2(根据需要放大或缩小)时获取细胞(20 OD600单位)，并在溶液B中洗涤一次。
2. 在溶液B (OD600 = 2.0)中重悬，在30℃下振荡孵育15分钟。
3. 收集细胞并重新悬浮于溶液C (OD600 = 1.0)中。
4. 通过温和倒置溶解酶20T (0.2 mg)，并在30℃下偶尔轻轻摇晃15分钟。
5. 以3000 g保存3 min收获球质体。
6. 将颗粒重新悬浮于溶液C中并转移至微离心管中。
7. 将球质体悬浮液以3000 g离心3 min
液泡的分离
对于700-800 OD600个单位的球质体
1．将球体球重悬于1 ml溶液D中。
2．在23℃孵育5分钟(在2.5分钟时倒置一次)。
3．通过5000 g离心5 min使含有空泡的部分沉淀。
4．将液泡小球悬浮于4 ml 12%多聚蔗糖溶液中。
5．在13 ml管中为摇桶转子层各4 ml样品中加入12%多聚蔗糖、10%多聚蔗糖和4%多聚蔗糖及1 ml溶液D。
6．在8℃下，100,000 g离心90分钟。
7．从4%多聚蔗糖/溶液D界面收集液泡。
8．用2体积的溶液D稀释液泡部分，60000 g离心15分钟收集。
空泡和空泡下囊泡的分离
1．梯度溶液:用溶液F稀释溶液A，给予11%和22% (w/v)碘克沙醇(分别为1.06和1.12 g/ml)。
2．将液泡部分悬浮于0.2 ml F溶液中。
3．在大约2 ml的TLS55摇摆桶转子层管中，0.5 ml 22% (w/v)碘克沙醇，1.3 ml 11% (w/v)碘克沙醇和0.3 ml样品。
4．在12℃下以16万g离心60 min。
5．液泡囊泡在溶液F/11%碘克沙醇界面，液泡下囊泡在11%/22%碘克沙醇界面。
从酵母球质体裂解液中分离液泡和Cvt囊泡（Vacuoles and Cvt vesicles）
1．配制含10 mM k管的50% (w/v)碘克沙醇工作液(WS)，pH 6.8，用相同的缓冲液稀释，得到30%，25%和19% (w/v)碘克沙醇梯度溶液。
2．在水中裂解球质体;将裂解液调整到10 mM K-Pipes, pH 6.8，并与WS混合，使最终碘克沙醇浓度为37% (w/v)。
3．在Beckman SW41Ti管中，Sorvall TH641(或类似物)用2 ml每种梯度溶液和K-Pipes缓冲液覆盖3 ml该裂解产物以填充管。
4．在4℃下以约80,000 g离心4 h。
5．缓冲/19%界面处出现空泡带，37%/30%界面处出现Cvt囊泡。
方法注释
裂解介质和梯度溶液
蛋白酶抑制剂应添加到用于球质体的溶液中，并在后续操作的溶液中。
从梯度中获取带状材料
在这些分辨率良好的分离中，感兴趣的材料可以简单地吸入装有扁头金属套管的注射器(径约0.8毫米)。小容量的导管最好通过导管穿刺或从半月板抽吸来卸载。
结果分析
小体积不连续碘克沙醇梯度的组分在SDS凝胶上运行，并检测前体API (prAPI)和ALP(分别为液泡下和液泡标记物)。样品/11%碘克沙醇界面处的粗液泡分数(V)和带状物质界面富集于液泡囊泡(VV)， 11/22%碘克沙醇界面富集于液泡下囊泡(SV)，以及两个11%和22%碘克沙醇层(LD和HD)。
液泡和前液泡分离
由Chen和Kaplan设计的连续碘克沙醇梯度系统主要用于研究酵母线粒体对铁的摄取，也分离液泡和液泡前组分。
在对酵母Myo2p的研究中，Chang等使用了小体积的自生成碘克沙醇梯度。2000 g/10 min酵母裂解物上清液在150 mM KCl, 2 mM MgCl₂，1 mM EGTA, 0.2% TX100, 2 mM DTT, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.2下在2000 g 10 min, 30,000 g 30 min和100,000 g 1h下进行差速离心。最终离心包括0.1 ml 60% (w/v)蔗糖垫。将100,000 g颗粒重悬于0.75 ml裂解培养基(加上缓冲液)和0.85 ml OptiPrep™中。在小体积转子(贝克曼TLA 120.2)中以287,000 g将其离心2 h。虽然垂直(或近垂直)转子通常用于产生自生成的梯度，但这种小体积的固定角转子具有理想的低沉降路径长度(约15毫米)。在分泌泡和核糖体中，靠近梯度顶部的液泡也显示出独特的带型。
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