【Serumwerk】内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离——连续的碘二醇梯度（1.5-3 h旋转）
内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 均质培养基(HM): 0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4
C. 稀释剂:0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 60 mM Hepes-NaOH, pH 7.4
D. 50% (w/v)碘克沙醇(ρ = 1.272 g/ml)工作溶液(WS): 5体积溶液A + 1体积溶液C
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。
1．用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次以去除培养液，然后用溶液B洗涤1次，然后用该溶液重悬。
2．将细胞悬浮在小体积的溶液B (0.5-5.0 ml)中，通过Dounce匀浆，通过细注射器针头或滚珠轴承匀浆器重复传代来破坏细胞。
3．将匀浆以2000 g离心10 min并收集上清液。
4．可选步骤:将上清液以100,000 g离心40分钟，然后将颗粒重新悬浮于1-2 ml溶液B中。
5．用溶液B和D分别配制2%和25% (w/v)碘克沙醇溶液24:1和1:1 (v/v)。
6．使用双腔梯度发生器或Gradient Master从等体积的2%和25%碘克沙醇溶液中制备12- 13ml梯度，用于摇摆桶转子。
7．将囊泡悬浮液层置于梯度上，以200,000 g离心2-3 h。
8．收集梯度0.5 ml。
方法注释
1. 可根据操作者的判断将蛋白酶抑制剂包括在溶液B和C中。溶液B和C可含有备用缓冲液(例如三酰甘油、三酰甘油或三乙醇胺)。
2. 虽然传统上使用含EDTA的蔗糖缓冲等渗溶液作为细胞器分离的HM，但有一种趋势是使用更多的离子介质，包括NaCl或KCl(或两者)，特别是对于培养的细胞。
3. 也可以使用其他的摇斗转子甚至垂直转子。较大容积的摇斗转子可能需要更长的离心时间，但垂直转子将需要更短的时间。大多数的梯度已在5或14毫升的管中运行。
4. 如优选，可用生理盐水洗涤细胞可在室温而非4℃下实施。Yang等人在匀浆前使用含0.21 M蔗糖、0.75 mM KCl、19 mM NaCl、1 mM EDTA的改良匀浆缓冲液洗涤细胞。
5. 同质化方案需要根据细胞类型进行调整。采用均质化或通过25号注射器针头进行12-15通道或有时两种方法的组合是常见的。滚珠轴承均质器(“细胞裂解器”)现在被广泛认为是最有效和可重复的设备之一。
6. 可将颗粒重悬浮于溶液B中;重复离心，必要时将两种上清液合并。该策略可回收第一个颗粒中被困的膜囊泡。
7. 使用低速上清液进行梯度输入的优点是过程更快，并且上清液中的囊泡不会进一步暴露于使100,000g颗粒重悬所需要的剪切力中。另一方面，如果去除任何可溶性细胞溶质蛋白很重要，或者如果低速上清液的体积大得不方便，那么制备100,000g的颗粒可能是有用的步骤。
8. 选择2%碘克沙醇溶液(而不是溶液B)以使样品更容易分层。用于形成梯度的碘克沙醇的浓度是可变的;它们可以根据操作人员的要求进行定制。如果主要感兴趣的是较低的密度分数(例如高尔基体、PM或核内体)，则2-18%碘克沙醇梯度可能更有用。如果主要感兴趣的是密度较大的区域，则可能需要15%-40%的梯度。
9. 如果这两种梯度制造装置都不可用，则可以通过扩散不连续梯度来制备连续梯度。
10. 有证据表明，粒子浮选比沉降能提供更好的分辨率。使用这种方法时，应将梯度调整为2-22% (w/v)碘克沙醇，囊泡悬浮液调整为25% (w/v)碘克沙醇，然后使用注射器和金属套管(i.d 0.9 mm)在梯度下分层。
11. 亦可调节离心时间和/或RCF (g-force);较小的体积梯度可能需要较短的时间(例如1.5 h)和/或较低的RCFs (100-150,000g)。
12. 通过导管穿刺、向上移位或从半月板抽吸收集梯度。
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