【Serumwerk】通过不连续梯度浮选从培养细胞中分离质膜

A. OptiPrep™

B. 均质缓冲液(HB): 0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 2 mM MgCl₂(可选)，20 mM Hepes-NaOH, pH 7.4

C. 稀释剂:0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 12 mM MgCl₂(可选)，120 mM Hepes-NaOH, pH 7.4

D. 50%碘克沙醇(ρ= 1.272 g/ml)的工作溶液(WS): 5体积的溶液A + 1体积的溶液C

除在0-4℃用磷酸盐缓冲盐水洗涤(步骤1)外，执行所有操作。

1．用磷酸盐缓冲液洗涤2次以去除培养液，然后用溶液B洗涤1次。

2．将细胞悬浮于小体积的溶液B中(2.5×10⁷细胞溶于0.5-1.0 ml)

3．通过使用精细的注射器针头(例如使用25G针头最多20次)、滚珠匀浆器(3-10次)或使用紧密的Dounce匀浆器的杵20次来破坏细胞。

4．以2000 g将匀浆离心10 min并收获上清液。

5．将上清液以100,000 g离心40-60 min。

6．将溶液D和B分别混合，配制2.5%、10%、17.5、25%和30% (w/v)碘克沙醇溶液2.5:47.5、1:5、17.5:32.5、1:1和3:2 (v/v)。

7．将步骤5中的颗粒悬浮于0.75 ml 30%碘克沙醇中。

8．使用注射器和金属套管，从2.5%、10%、17.5%和25%的碘克沙醇中各取3ml，在13ml的管中制备一个不连续的梯度，最后在30%碘克沙醇中取样。

9．以165,000 gav离心3.5小时。

10．通过置管、向上移位或从半月板抽吸的方法收集梯度，每0.5 ml收集1次。

一、均质介质和梯度溶液

通常必须将均质培养基裁剪成组织或细胞类型并且不知道HM的组成是否与分离相关。使用OptiPrep™的方法都使用了0.25 M蔗糖缓冲液与Tris, Hepes, Tricine或三乙醇胺(10-20 mM浓度)，并且通常(但不总是)含有1 mM EDTA。用无机盐补充HM变得越来越常见，可以减少离子相互作用，膜之间的聚集，并对抗任何由于细胞骨架蛋白引起的匀浆粘度的提高。一些不含蔗糖的培养基完全使用氯化钠或氯化钾或两者作为主要的渗透平衡剂。HM的组成也应与任何后续分析过程兼容。二价阳离子的加入可以防止核破裂;一般稳定膜，但可能导致聚集。

50%碘克沙醇工作液(溶液D)的制备确保EDTA(和MgCl₂，如果包括在内)和缓冲液的浓度在所有梯度溶液中是恒定的。

二、均质化

理想情况下，操作应尽可能温和和可重复，目的是造成至少95%的细胞破坏，而不破坏主要细胞器，特别是细胞核和溶酶体。均质化过程的类型和严重程度将对细胞器的完整性和细胞质中由管状结构产生的囊泡的大小产生影响。因此，膜带在任何后续梯度中的模式可能不容易预测。

三、差速离心（分离）

核的去除

可在500-3000g下进行5-10 min的核造粒;更高的RCFs (g-force)导致一些线粒体的去除，这可以促进后续样品在梯度上的分层。为了回收被困在颗粒中的任何囊泡(在RCFs较高的情况下更严重)，有时将颗粒重新悬浮在HM中，离心，并将两种上清液结合在一起。这种做法的一个可能的缺点是，除非颗粒的重悬非常温和，否则细胞核可能被破坏，从而导致DNA的泄漏，这可能导致亚细胞膜几乎不可逆的聚集。

梯度加载样品的准备

如果样品的大小足够小，则可省略此步骤并且将2000g上清液本身调整为高密度以便在梯度下加载。由于在随后的离心过程中，胞质蛋白仍然停留在梯度的底部，这种做法应该不会对回收的质膜的纯度有害。

四、密度梯度

备选梯度

其他用于质膜浮选的梯度有:

对于PC12细胞，5%，10%，15%和20% (w/v)碘克沙醇，样品置于25% (w/v)碘克沙醇中

对于MCF-7细胞，20%和24% (w/v)碘克沙醇，样品置于32% (w/v)碘克沙醇中

最初设计用于从果蝇中分离PM的三层不连续梯度也被用于从小鼠胚胎中分离PM。将胚胎匀浆于150 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 100 mM Tris-HCl, pH值7.4中，并将核后上清液与OptiPrep™混合至40% (w/v)碘克沙醇溶液中，并覆盖30%和5%碘克沙醇。在100,000 g离心3小时后，质膜从顶部界面收获。

五、离心条件

其他已使用的离心条件是：对于PC12细胞，88000g，17小时；对于MCF-7细胞，83000g，2小时。

六、分析

在5%、10%、15%、25%、30%碘克沙醇浮选梯度下，从PC12细胞的质膜上分离出EGF受体，并在5/10%和10/15%界面进行鉴定。来自MCF-7细胞的PM也在20%碘克沙醇层的顶部显带，而来自小鼠星形细胞瘤细胞的PM也是最不致密的膜。在后一种情况下，PM标记(转铁蛋白受体)显示出明显的双相特征，有趣的是，鼠冠状病毒刺突蛋白(s蛋白)局限于高尔基体和更致密的质膜成分。这意味着这个梯度可能能够解决PM的子部分。

质膜既不与核内体重叠，也不与高尔基体标记重叠。PC12细胞的核内体标记物EEA1和Rab5B几乎全部从25% /30%的界面区域(1.15-1.175 g/ml)中回收，在MCF-7细胞中，Rab5和rab11在20%碘克沙醇条带中回收。来自小鼠星形细胞瘤细胞的高尔基体标记物(Syntaxin 6)在17.5-25%碘克沙醇区域的梯度底部条带。因此，与顶部负载的梯度相比，在这些浮选梯度中，核内体和高尔基体的条带密度出乎意料地高。另一方面，MCF-7细胞的线粒体(mHSP70标记)的位置与预期基本一致。

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