【Serumwerk】内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离——浮力密度分馏

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

不连续梯度

在Kleene等人设计的用于神经母细胞瘤细胞的替代方法中，从12,000 g/15分钟的上清液中沉淀微粒体部分；然后将其重新悬浮于0.32 M蔗糖、10 mM Tris-HCl、pH 7.4中并调整为20% (w/v)碘克沙醇。它在30%和15%碘克沙醇之间分层，并在150,000 g离心3小时。SER在15%/20%碘克沙醇界面和RER 20%/30%碘克沙醇界面条带。

将20% (w/v)碘克沙醇中的粗微粒体分层至30% ~ 15%碘克沙醇的策略是Sigma-Aldrich内质网分离试剂盒(Sigma-Aldrich Endoplasmic Reticulum Isolation Kit)中推荐的方案的一部分。已有文献报道其用于神经母细胞瘤细胞和小鼠胰腺。一些方法省略了轻线粒体离心步骤，离心20万g的核后上清液(PNS)；然而，在梯度输入中所有其他主要细胞器(线粒体、过氧化物酶体和溶酶体)的存在将严重考验梯度的有效性。强烈建议包括12000 g离心的PNS。

最近Ramming等人使用20%，16.25%，12.5%，8.75%和5% (w/v)碘克沙醇的不连续梯度，在大约100,000 g在小体积的摆动桶转子(2.2 ml管)中离心3小时。

连续梯度

Geiger等人将来自CHO细胞的核后上清液的所有膜沉淀(100,000 g 1 h)；将它们重新悬浮在0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 10 mM Hepes-NaOH Tris-HCl, pH 7.4中，并在约0.5 ml的层状上放置。13 ml 0-15% (w/v)碘克沙醇梯度(用相同的培养基稀释OptiPrep™制备)。75000 g离心18 h后，RER出现在梯度底部，SER→ERGIC出现在梯度顶部。Uribe用于巨噬细胞的密度范围更广(0-26%碘克沙醇)。将来自HeLa细胞匀浆的2000 g上清液调整为40% (w/v)碘克沙醇并且在0-35% (w/v)碘克沙醇梯度下装载。94,000 g离心17小时，从细胞骨架中分离出宽条带的内质网，保留在梯度的底部。在从膜中解析可能致密的蛋白质成分时，底部加载当然是所选择的样品加载方法。

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