【Serumwerk】细胞和组织中纯化：单层细胞均质化（Cell homogenization in monolayers）
单层细胞均质化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
使用等渗介质
溶液制备
A. 磷酸盐缓冲盐水(PBS)
B. 0.25M蔗糖，10 mM三乙醇胺-10 mM乙酸，pH 7.8(用三乙醇胺或乙酸调整到正确的pH，而不是用HCl或NaOH)
C. 溶液B含1mm EDTA
试验方法
1．使用接近融合的单层。
2．去除介质并用溶液A(在室温下)冲洗单层至少三次。然后用溶液B(同样在室温下)洗涤单层至少两次。
3．向培养皿中加入冰冷的溶液C(对于9厘米的培养皿，大约2毫升)，用橡皮淀帚将细胞刮到培养基中。不要尝试制造单细胞悬液。
4．将重悬的单层细胞转移到有冰的烧杯中，如果需要，再用1ml溶液C清洗盘子，以回收剩余的细胞。重复这个步骤。
5．如果体积太大，离心细胞，然后用体积更小的溶液C重新悬浮颗粒。同样，不要尝试制造单个细胞悬液。
6．使用紧密的Dounce匀浆器的舂杵进行10-25次匀浆。在相差显微镜下观察10次后的悬浮液。继续均质化直到约90%的细胞破碎。
7．缓冲液是该方法成功的关键，没有替代物是令人满意的。
替代低渗均质介质
溶液制备
A. 15mM KCl, 1.5 mM醋酸镁，(MgOAc) 1 mM二硫苏糖醇(DTT)， 10 mM Hepes-KOH, pH 7.5。
B. 375mM KCl, 22.5 mM MgOAc, 1mM DTT, 220 mM Hepes-KOH, pH 7.5
C. Hepes缓冲盐水(HBS)。
试验方法
1．在溶液C中洗涤细胞两次，以去除所有培养基。
2．将细胞悬浮于10 ml溶液A中，并在冰上膨胀10分钟。
3．将细胞离心并去除足够的上清液以留下相当于细胞颗粒3.5倍的体积。
4．在紧密配合的Dounce均质器中均质，然后加入溶液B体积的1/5。
培养基的离子成分倾向于避免细胞骨架蛋白形成任何“凝胶”，通过在小体积内均质化，被释放的细胞器受到细胞溶质蛋白的保护，免受低渗休克。
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