【Serumwerk】内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离——沉降速度梯度
内质网、质膜、核内体、高尔基体、ERGIC和TGN分离不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. OptiPrep™
B. 磷酸盐缓冲盐水
C. 细胞洗涤培养基:140 mM NaCl, 30 mM KCl, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4
D. 均质介质:130 mM KCl, 25 mM NaCl, 1 mM EGTA, 25 mM Tris-HCl, pH 7.4
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。
●虽然已发表的方法涉及多步骤连续梯度的构建，但在制备和离心过程中，梯度本质上变得连续和线性。一个更简单的选择可能是在开始时制作一个连续梯度
1．对于不连续梯度:用溶液D稀释OptiPrep™，制备5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%和25% (w/v)碘克沙醇溶液。对于连续梯度，仅制备5%和25% (w/v)碘克沙醇溶液。
2．在溶液B中洗涤细胞两次，在溶液C中洗涤两次。
3．将细胞重新悬浮于溶液D中，并使用滚珠均质器(细胞裂解器)或通过重复传代(约10通道)通过一个窄规注射器针头(24-25G)或使用一个紧密型Dounce匀浆器。
4．通过3000 g离心10 min去除细胞核和重线粒体部分。
5．在离心过程中，分别从1.2 ml (13ml管)或1.7 ml (17ml管)的9种碘克沙醇溶液中制备不连续的梯度，或者使用双腔梯度标记器或Gradient Master™分别从等体积(5.5 ml或7.5 ml)的两种碘克沙醇溶液中制备分别用于13ml或17ml管的梯度。
6．将0.5-1.0 ml来自步骤4的上清液分层到每个梯度的顶部。
7．126,000 g离心30分钟。
8．用密集溶液向上移位获取梯度，通过导管穿刺或从半月板抽吸0.5-1.0 ml，用于分析。
方法注释
1．蛋白酶抑制剂(PMSF，白细胞肽素，抗疼痛药，抑肽酶等)可根据操作者的判断包含在任何或所有介质中。
2．Majoul等人使用了一种稍微不同的不连续碘克沙醇梯度，其中两种密度最大的溶液是25%和30% (w/v)碘克沙醇，而不是22.5%和25%。
3．有些细胞在均质化之前可能需要渗透性溶胀。低渗介质可以是简单的低浓度缓冲液，如10mm Hepes-KOH, pH 7.5。一定要尽快将匀浆恢复到等渗状态。
4．注意，匀浆的体积应保持在最低限度;由于分离是基于沉降速度，因此每个梯度上只能放置0.5-1.0 ml的材料。
5．可在3000 g离心之前插入可选的1000 g/10 min步骤。这可能会阻止大量快速沉降的核和碎片捕获许多其他较小的颗粒。注意，在浮力密度分级中，通常使用高g (12,000 g)去除较大的细胞器。
6．如果3000g上清液的体积大得令人不便，则可能需要以100,000 g使所有颗粒材料成球45 min，并以较小体积重悬颗粒。微粒体的离心条件不同，Higashi用138,000 g离心1 h。
7．一旦确定了SER和RER带的位置，就可以用注射器将其取出。SER峰值约为1/3,RER峰值约为2/3。
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