【Serumwerk】从酵母球质体中分离粗制线粒体部分——连续碘克沙醇梯度沉降
从酵母球质体中分离粗制线粒体部分不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. 球体缓冲液：1.2 M山梨醇，20 mM磷酸盐缓冲液，pH值7.4
B. 球体溶解培养基：0.6 M山梨醇，20 mM MES-KOH, pH 6.0
球质体生产
该方案是为约35-40 g包装酵母细胞。
1. 每g细胞使用2.5 mg酶20T，并溶解于溶液A(每g细胞2 ml)中。
2. 用40 ml溶液A洗涤细胞并以2000 g离心5 min。
3. 除去上清液，将细胞颗粒悬浮于酶溶液中，30°摇匀孵育30 min。
粗线粒体生产
在0-4℃下执行所有操作。可根据需要按比例缩小该方案。
1. 将球体悬浮液以4000 g离心5 min。
2. 将来自约35 g湿重酵母细胞的球质体以40 ml /球质体颗粒悬浮于溶液A中，并以4000 g离心5 min。
3.取出上清液，重复步骤1和2。
4. 将每个球质体颗粒重新悬浮于50 ml溶液B中，并在密式Dounce均质器(惠顿a型)中使用舂槌15次均质。
5. 用溶液B (1.5体积)稀释匀浆，1500 g离心5 min，使细胞核和未破碎的细胞成球。
6. 滗出并保留上清液;由于颗粒可能是松散的包装，最好使用20毫升注射器和金属套管吸出上清液。
7. 将每个颗粒重新悬浮于溶液B中，重复步骤4-6。
8. 合并上清液并以12,000 g离心10分钟。
9. 将上清液滗出，并用宽松型(惠顿B型)Dounce匀浆机的舂棒轻轻敲打3-4下，将粗制线粒体颗粒重新悬浮于溶液B中。
10. 将悬浮液以1500 g离心5 min以去除任何聚集物和碎片。
11. 使用注射器和金属套管，仔细吸取上清液;重复步骤8并将颗粒重新悬浮于第3-5部分所述的溶液之一中。
连续碘克沙醇梯度沉降
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。可根据需要按比例缩小该方案。
1．将溶液C和D分别以2:38 v/v和25:15 v/v的比例混合，制备2%和25% (w/v)的碘克沙醇溶液。
2．使用双腔梯度发生器或gradient Master™从等体积的两种溶液中构建线性梯度。在13 ml的导管中，总梯度容积应约为11 ml;17毫升试管中约14毫升，38毫升试管中约30毫升。
3．用宽松的Dounce匀浆机的杵轻轻敲击2或3下，将粗制线粒体悬浮在约40 ml的溶液D中，然后以12,000g离心10分钟。
4．将洗涤后的粗线粒体颗粒悬浮于10-20 ml的溶液D中，并在线性梯度上分层，根据制造商的规格填充管。
5．5.12000 g离心2小时。
6．通过导管穿刺、用致密介质向上移位或从半月板抽吸，获取0.5-2.0 ml的梯度。
方法注释
1. 如果没有梯度标记物，可以通过让2%、8%、14%、20%和25%碘克沙醇等量的不连续梯度扩散来制备梯度。
2. Chen和Kaplan引用了0 ~ 25%的碘克沙醇梯度，但2 ~ 25%的梯度不会影响后续分离，更容易带样。
3. 这一梯度已被用于酵母线粒体积累铁的研究。
其他梯度
Ishihara使用的梯度包括以下碘克沙醇(w/v)溶液:溶液B中10% (1.5 ml)、15% (2 ml)、20% (2 ml)、25% (1.5 ml)、30% (1 ml)、40% (1 ml)和50% (0.5 ml)。将其在174,000g下离心16小时，并在离心过程中变得连续。在这个梯度中，内体和空泡带状分布在梯度的顶部1 / 3，而线粒体的峰值相当急剧，约为25%。梯度的最终连续密度剖面将反映碘克沙醇在界面上的扩散和靠近管底部的碘克沙醇分子的沉降。
Kerssen等使用较窄范围的连续梯度；15.5 - 36% (w/v)碘克沙醇梯度，也含有18%的蔗糖，主要用于过氧化物酶体输入受体(Pex5p)的研究，但也产生了非常清晰的线粒体带。2.25-24% (w/v)碘克沙醇在30,000 g或48,000 g下在垂直转子中离心90分钟也能很好地分离线粒体和过氧化物酶体。
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