【Serumwerk】从酵母球质体中分离粗制线粒体部分——不连续碘克沙醇梯度浮选
从酵母球质体中分离粗制线粒体部分不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
溶液制备
A. 球体缓冲液：1.2 M山梨醇，20 mM磷酸盐缓冲液，pH值7.4
B. 球体溶解培养基：0.6 M山梨醇，20 mM MES-KOH, pH 6.0
球质体生产
该方案是为约35-40 g包装酵母细胞。
1. 每g细胞使用2.5 mg酶20T，并溶解于溶液A(每g细胞2 ml)中。
2. 用40 ml溶液A洗涤细胞并以2000 g离心5 min。
3. 除去上清液，将细胞颗粒悬浮于酶溶液中，30°摇匀孵育30 min。
粗线粒体生产
在0-4℃下执行所有操作。可根据需要按比例缩小该方案。
1. 将球体悬浮液以4000 g离心5 min。
2. 将来自约35 g湿重酵母细胞的球质体以40 ml /球质体颗粒悬浮于溶液A中，并以4000 g离心5 min。
3.取出上清液，重复步骤1和2。
4. 将每个球质体颗粒重新悬浮于50 ml溶液B中，并在密式Dounce均质器(惠顿a型)中使用舂槌15次均质。
5. 用溶液B (1.5体积)稀释匀浆，1500 g离心5 min，使细胞核和未破碎的细胞成球。
6. 滗出并保留上清液;由于颗粒可能是松散的包装，最好使用20毫升注射器和金属套管吸出上清液。
7. 将每个颗粒重新悬浮于溶液B中，重复步骤4-6。
8. 合并上清液并以12,000 g离心10分钟。
9. 将上清液滗出，并用宽松型(惠顿B型)Dounce匀浆机的舂棒轻轻敲打3-4下，将粗制线粒体颗粒重新悬浮于溶液B中。
10. 将悬浮液以1500 g离心5 min以去除任何聚集物和碎片。
11. 使用注射器和金属套管，仔细吸取上清液;重复步骤8并将颗粒重新悬浮于第3-5部分所述的溶液之一中。
不连续碘克沙醇梯度浮选
溶液制备
A. OptiPrep™
B. OptiPrep™稀释缓冲液:0.8 M山梨醇，60 mM Hepes-KOH, pH 7.4
C.碘克沙醇(40% w/v)工作溶液:2体积溶液A + 1体积溶液B
D.线粒体悬浮缓冲液:0.6 M山梨醇，20 mM Hepes-KOH, pH 7.4
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。可根据需要按比例缩小该方案。
1．用松散的Dounce匀浆器的杵，12000g，将粗线粒体悬浮入约40 ml溶液D中10 min。
2．将洗涤后的粗线粒体颗粒悬浮于20 ml溶液C中。
3．用溶液D(3 + 7、6.25 + 3.75 v/v)稀释溶液C，配制ρ = 1.10、1.16 g/ml的碘克沙醇溶液。
4．在管中为38 ml的摇桶转子层10 ml的线粒体悬浮液和约14 ml的ρ = 1.10和1.16 g/ml溶液。如果使用较小体积的转子，则按比例缩小所有体积。
5．以80000 g离心3 h。
6．收集线粒体带；用4体积的溶液D稀释，在10,000 g下收获纯化的细胞器10分钟。
7．在3,000 g下离心5 min去除任何聚集材料。
方法注释
1. 通常使用山梨醇作为主要渗透平衡剂将酵母球质体裂解物调节到500-600 mOsm的渗透摩尔浓度。使用40%碘克沙醇工作溶液制备约560 mOsm和750 mOsm的溶液。如果需要较高浓度的碘克沙醇溶液，强烈建议使用渗透压计检查溶液的渗透压，并根据需要调整溶液A，使溶液B达到所需的渗透压。
2. 必须尽可能轻柔地实施任何粗制线粒体颗粒的重悬。
3. 在Meeusen的方法中，将粗制的线粒体颗粒重悬于50%碘克沙醇中，而不是40%碘克沙醇中。这不会影响分离的效果。
4. 值得注意的是，不连续梯度可以适应线粒体颗粒在1.16 g/ml溶液中的中位负荷。据认为，中间负载的线粒体所经历的较低的静水压是其原因。
Tamura和Chatterjee也采用了该方法。
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