【Serumwerk】光线粒体组分纯化分析——在自生成碘克沙醇梯度中纯化

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Serumwerk Bernburg AG

Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

小白求助前辈指路

光线粒体组分纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！

溶液制备

A. OptiPrep

B. OptiPrep稀释剂(OD): 0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 120 mM Hepes- NaOH, pH值7.4

C. 工作溶液(WS): 50%碘克沙醇(ρ= 1.272 g/ml): OptiPrep溶液A + 1体积OD

D. 均质介质(HM)：0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 20 mM Hepes-NaOH, pH值7.4

试验方法

所有操作应在0 ~ 4℃进行。

1. 将重悬的轻线粒体颗粒与WS混合，形成所选择的碘克沙醇最终浓度：15%、17.5%或20% (w/v)。

2. 转移到管为垂直，近垂直或低角固定角转子(约20°)。用样品填充管腔容积的90 ~ 95%，然后在顶部涂上HM填充管腔。

3.采用353,000 g的垂直或近垂直转子离心1-2小时，或采用270,000 g的固定角度离心3小时；允许转子在没有刹车的情况下从2000转/分钟开始减速或使用缓慢减速程序。

4. 以0.5-1.0 ml为单位，通过向上位移卸载梯度液，如果这是不切实际的，可以使用管道穿刺或从底部抽吸。

方法注释

1. 根据操作者的决定，蛋白酶抑制剂可包括在OD中。

2. 应通过确定空白梯度的密度分布，来评估自生成梯度的转子的效能。通过折射率(RI)测量可以最准确地确定所收集部分的密度。

3.碘克沙醇的最佳最终浓度将取决于操作者的要求(即是否有必要溶解所有的细胞器或一个特定的细胞器)。

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发布日期：2024-03-05 14:14:25
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