【Serumwerk】光线粒体组分纯化分析——在连续碘克沙醇梯度中纯化
光线粒体组分纯化不成功、实验做不出来怎么办？新手小白迫切求助，希望各位前辈在文章下方留言，分享自己的经验，为小白们答疑解惑！
LMF或HMF+LMF的制备
溶液制备
均质培养基(HM): 0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 20 mM Hepes-NaOH, pH值7.4
试验方法
在0-4℃下执行所有操作。
为了制备HMF+LMF，请省略步骤6-8并使用合并的1000 g上清液(来自步骤5)而不是步骤9中的3000 g上清液。
1. 对于软组织：用剪刀(或组织斩刀)将组织切碎，然后用HM转移到Potter-Elvehjem(特氟龙和玻璃)匀浆器(每2.5 g组织使用10 ml)。在500-700转/分的转速下，用舂槌敲击约6次使其均质化。
2. 细胞:1-3×10⁸细胞用5 ml磷酸盐缓冲液洗涤，再用5 ml HM洗涤。将细胞悬浮于3 ml HM中，并在滚珠轴承匀浆器中使用5次匀浆。
3.将匀浆1000gav离心5分钟，使核成球(不要使用刹车来减速转子)；然后小心地倒出上清液或用注射器和金属套管吸出，并放在冰上。
4. 使用宽松的Dounce匀浆器的舂棒轻轻敲击2-3次，将颗粒重新悬浮于10 ml HM中(对于细胞来说是5 ml)。
5. 重复离心并合并上清液。
6. 为了使HMF颗粒化，将悬浮液在3000 gav下离心10分钟，然后抽吸或滗出上清液并保存在冰上。
7. 重悬约为HM原始体积的一半的3000 g颗粒(HMF)。
8. 使用宽松的Dounce匀浆器轻轻匀浆颗粒并重复步骤6。
9. 将合并的3000 g上清液以17000 gav离心10-15分钟。
10. 将颗粒(LMF)重新悬浮在小体积(约2 ml)的HM，使用宽松的Dounce匀浆器。
方法注释
1. 可根据操作者的判断将蛋白酶抑制剂包括在HM中。
2. 可使用任何适宜的缓冲等渗溶液并且文献中HM的详细组成有相当大的变化。对于大鼠肝脏，最“线粒体友好”的培养基是基于0.25 mM甘露醇而不是蔗糖，并且EDTA常被0.1 mM EGTA取代。或者，过氧化物酶体特异性培养基通常含有0.1% (v/v)乙醇。MOPS是另一个常用的缓冲区。
3.所述方法适用于组织，例如啮齿动物的肝和肾。其他组织如骨骼和心肌、肠道和大脑需要特殊处理，操作者应查阅相关文献。
4. 滚珠轴承均质器(细胞裂解器)通常被认为是培养细胞的最佳设备之一;这种技术能最好地保存脆弱的细胞器。如果没有，剪几个通道通过注射器针头可能是一个可靠的替代方案。
5. 细胞核可能非常脆弱，因为任何含有EDTA的均质培养基都不适合保存这些细胞器。必须非常轻柔地清洗颗粒。
6. 可使用HM将LMF悬浮液洗涤至原始体积并重复步骤9和10，以去除被捕获的微粒体。
7. 如果悬浮液在梯度下分层，它可以重新悬浮在适当的溶液中或与密集的溶液混合。在后一种情况下，总容积可增加一倍或三倍。
分离LMF(或HMF+LMF)
溶液制备
OptiPrep™均质培养基(HM)：0.25 M蔗糖，1 mM EDTA, 20 mM Hepes-NaOH, pH值7.4
OptiPrep™稀释剂(OD)：0.25 M蔗糖，6 mM EDTA, 120 mM Hepes-NaOH, pH值7.4
50%碘克沙醇工作溶液(WS) (ρ = 1.272 g/ml)：5体积溶液OptiPrep™+ 1体积OD
试验方法
将梯度调至0-4°C，并在此温度下执行所有后续步骤。
1. 用HM稀释WS以产生碘克沙醇浓度为19%和27% (w/v)碘克沙醇的梯度溶液。
2. 使用双腔梯度发生器或Gradient Master™从两种梯度溶液各6.0 ml中准备一个线性梯度，在17 ml管中用于摆动桶转子。
3.将LMF或HMF+LMF混悬液与WS混合，调整为30%碘克沙醇，并在梯度下分层3-4 ml。
4. 在梯度上层1-2毫升HM填充管到3-4毫米，从管的顶部和离心在一个合适的摆动桶转子约70000 g 1.5-2小时。使用一个缓慢减速程序，或如果没有一个可用的允许转子从2000 rpm减速，而没有刹车。
5. 通过导管穿刺或从半月板抽吸，先将低密度端向上移位，或先将高密度端小心地插入一个狭窄的金属套管(连接蠕动泵)到管的底部，以1 ml的梯度收集。
方法注释
1. 根据操作者的决定，蛋白酶抑制剂可包括在OD中。
2. 其他管容量的转子是允许的，例如贝克曼SW41Ti(大约13 ml)或SW28(约39毫升)。按比例放大或缩小给出的体积。也可以使用像贝克曼VTi50这样的垂直旋翼。这种转子的短路径长度降低了细胞器上的静水压力，并允许减少g力或离心时间。
3.19%和27% (w/v)碘克沙醇溶液的密度分别为1.124和1.162 g/ml。
4. 对于其他组织或细胞类型和个性化要求，可能需要调整梯度的密度范围。
5. 如果这些装置中的一个是不可用的，则可以通过不连续梯度的扩散来制备连续梯度。以等体积的19%、22%、25%、27%碘克沙醇制备19 ~ 27%碘克沙醇梯度。
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