【Serumwerk】来自非哺乳动物来源的细胞外囊泡（Extracellular vesicles）——预梯度法

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Serumwerk Bernburg AG 1893 OptiPrep™

通过中速离心去除细胞

所有方法都包括细菌肉汤的初步澄清以去除完整的细胞；10000克是最常用的速度，通常为10-20 min，虽然也有更高重力的例子，13000g，15分钟和12000g，30分钟和更低的g力，8000g，30分钟，6000克，10-15 min和4000g，12分钟。新佛朗西丝菌可以通过5000g和7500g（都是30 min）去除；这可以通过大量快速沉积的完整细菌减少捕获，从而提高胞外囊泡（EV）的产量。离心条件的选择似乎不是细菌类型特异性的。然而，真菌细胞（如新型隐球菌）似乎在较低的速度下沉积得令人满意-2500g，10 min。

通过体积减少计算的浓度

在密度梯度分析之前，在最后的超速离心步骤中，大量的澄清介质可能难以处理。Horstman and Keuhn在第一次中速离心后使用70 kDa截断切向过滤装置(Pall-Gelman)纯化大肠埃希菌OMVs，将体积缩小至原体积的1/25。同样的100 kDa截点装置也被用于铜绿假单胞菌、新杀弗朗西斯菌和流感嗜血杆菌。金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的病毒已被浓缩在QuixStand台式系统中，该系统具有100kda中空纤维膜(Amersham Biosciences)。将新型隐球菌膜囊泡（MV）浓缩于Amicon-Ultra离心过滤器(截断值也为100 kDa)中。在大多数情况下，在去除残留细菌的任何过滤步骤之前，对第一个中速离心步骤的上清液进行体积缩小。有时在通过0.45 μm滤器后进行超滤。偶尔重复初始中速离心。

通过过滤去除残留菌

在第一步离心后，残留的细菌和其他较大的污染物通常通过真空过滤通过0.45(最常见)或0.22 μm过滤器去除;有时，通过0.22 μm过滤器的过滤立即重复;有时序贯使用0.45和0.22 μm滤波器。在将膜囊泡造粒并在密度梯度加载之前或在超滤浓缩步骤之后重新悬浮于合适的介质中，重复过滤也很常见。

膜囊泡的沉积

在梯度分馏之前，MV常规地通过超速离心法(在固定角度的转子中)造粒;离心条件的变化是惊人的。大多数论文报告使用34- 40000 g为1小时，但也有更高的g力的例子:85000 g为1-2小时，100,000 g为1小时和140- 150000 g为2-3小时。

用硫酸铵沉淀

在少数情况下，通过硫酸铵沉淀从澄清液中收获MV。Ferndandez -Moreira等人首次报道了嗜肺军团菌OMVs。通过中速离心去除细菌，并通过0.45 μm滤器过滤培养液后，OMVs在4℃ 70% (NH₄)₂SO₄中沉淀30 min，然后在10,000 g离心15 min。将颗粒重悬在PBS中，并在该培养基上透析过夜。通过离心超滤(＞100 kDa截断值)进行浓缩。Bauman和Kuehn将(NH₄)₂SO₄浓度(71或75%)和沉淀时间提高到>3h;用HEPES缓冲液对重悬颗粒进行透析，并通过50kDa截断超滤浓缩。Ellis和Nieves 将(NH₄)₂SO₄沉淀时间增加到过夜。

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